动物DNA提取实验

在浓氯化钠（1-2 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。

小白鼠肝脏

NaCl EDTA-Na SDS 柠檬酸三钠 氯仿―异戊醇混合液 乙醇 二苯胺 无水乙醇 过氯酸

匀浆器 离心机 量筒 吸管 水浴锅 真空干燥器

一、试剂配制
 

1.  5 mol/L NaCl 溶液：将292.3 g NaCl 溶于水，稀释至1 000 ml。
 

2.  0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na 溶液： 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA-Na 于蒸馏水，稀释至1 000 ml。
 

3.  25% SDS 溶液： 溶25 g 十二烷基硫酸钠于100 ml 45% 乙醇。
 

4.  0.015 mol/L  NaCl 0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液： 氯化钠 0.828 g及柠檬酸三钠0.341 g 溶于蒸馏水，稀释至1 000 ml。
 

5.  氯仿-异戊醇混合液：氯仿：异戊醇=24：1（V/V）。
 

6.  1.5 mol/L NaCL-0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠 82.8 g 及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水，稀释至1 000 ml。
 

7.  3 mol/L乙醇钠 0.001 mol/L EDTA-Na溶液： 称取乙酸钠 408 g，EDTA-Na 0.372g 溶于蒸馏水，稀释至1 000 ml。
 

8.  70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，无水乙醇。

9.  1 mol/L过氯酸溶液：将10 ml 过氯酸（70%）用蒸馏水稀释至110 ml。
 

二、 DNA的分离纯化
 

1.  将10头小白鼠迅速杀死，取出肝脏，用0.14 mol/L NaCl 0.15mol/l EDTA溶液洗去血浆，剪碎，加入50 ml 0.14mol/L NaCl -0.15 mol/L EDTA溶液，置匀浆器中研磨，待磨成糊状后，将糊状物离心10分钟（4 000 r/min），弃去上清液，沉淀用0.14 mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次，所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
 

2.  向上述沉淀物加入0.14 mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液，使总体积为44 ml，然后滴加25% SDS溶液 3 ml，边加边搅拌，加毕，置60水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变的粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作是使核酸与蛋白质分离。
 

3.  加入5 mol/LNaCl 10 ml，使NaCl 最终浓度达到1 mol/L，搅拌10分钟，加入约一倍体积的氯仿―异戊醇混合溶液，振摇20分钟，离心10分钟（4 000 r/min）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.5-2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。
 

4.  将DNA粗品置于27 ml  0.015 mol/L  NaCl -0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中，再加入3 ml 1.5 mol/L NaCl-0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿―异戊醇混合液，振摇十分钟，离心（4 000 r/min，10分钟），倾出上层液体（沉淀弃去），加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复处理一次。
 

5.  将上步所得沉淀于27 ml  0.015 mol/L  NaCl-0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇，边加边搅，取出丝状DNA，依次用70%，80%，95%以及无水乙醇各洗一次，真空干燥。

为了防止DNA或（RNA）酶解，提取时加入EDTA（乙二胺四乙酸）。

试剂配制

1.  5 mol/L NaCl 溶液：将292.3 g NaCl 溶于水，稀释至1 000 ml。

2.  0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na 溶液： 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA-Na 于蒸馏水，稀释至1 000 ml。

3.  25% SDS 溶液： 溶25 g 十二烷基硫酸钠于100 ml 45% 乙醇。

4.  0.015 mol/L  NaCl 0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液： 氯化钠 0.828 g及柠檬酸三钠0.341 g 溶于蒸馏水，稀释至1 000 ml。

5.  氯仿-异戊醇混合液：氯仿：异戊醇=24：1（V/V）。

6.  1.5 mol/L NaCL-0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠 82.8 g 及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水，稀释至1 000 ml。

7.  3 mol/L乙醇钠 0.001 mol/L EDTA-Na溶液： 称取乙酸钠 408 g，EDTA-Na 0.372g 溶于蒸馏水，稀释至1 000 ml。

8.  70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，无水乙醇。

9.  1 mol/L过氯酸溶液：将10 ml 过氯酸（70%）用蒸馏水稀释至110 ml。