半乳糖也是E.coli的一种碳源，它的分解要涉及三种酶的催化：半乳糖激酶（galactokinase，K），半乳糖转移酶（galactose transferase,T）和半乳糖表面异构酶（galactose epimerase ,E,）。
Gal+ATP----->Glu-1-p+ADP+H+
半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。