单细胞测序前期常见问题解答

　目前，单细胞测序这项技术被应用的越来越多，领域包括了神经科学、肿瘤免疫、胚胎发育等等，您是否也计划着开展相关的研究呢？心中关于单细胞的疑惑就让古朵生物带您从常见问题出发，逐步拨开迷雾吧

　　1、为什么要做单细胞测序？

　　细胞与细胞之间的异质性，微环境里的细微差别，这些我们关注的信息都会被常规Bulk测序所掩盖，而单细胞水平可以将细胞一一分开，找到差异。单细胞测序shou次将我们的研究抛开上帝视角，深入到细胞内部，观察每一个细胞的差别和相似，除了基因层面，我们也可以在细胞层面和细胞类群层面进行多维度的解析。

　　2、单细胞测序对送样有什么要求？

　　制备好的单细胞悬液或血液、组织均可，质量要求：细胞活性大于80%，细胞浓度介于5*10^5—1.2*10^6/ml，细胞总数最好大于10^5个，细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+，细胞体积需小于40μm，大于5μm。不同物种、不同组织，包含的细胞类型多种多样。针对同一个组织，根据研究的生物学问题，对不同细胞类别的需求也是千差万别。派森诺的单细胞悬液制备研发团队，针对不同的物种、不同的组织类型、不同的实验处理方式、不同的感兴趣的细胞类型设计一对一高度个性化的解离方案。取样细节、运输细节，方方面面，为您高度个性化的研究保驾护航。

　　3、细胞悬液的制备过程中是否会影响基因的表达？

　　目前常用的方法中，不管是酶消化还是机械操作都会不可避免的对细胞产生影响，前者会使细胞产生应激反应，后者则容易损伤细胞，进而影响细胞活性。所以，在单细胞测序实验设计时，设置对照是非常重要的。前述的这些影响，在case和control中同样存在，我们关注case和control的差异表达基因，就可以去除实验的系统误差，找到决定感兴趣生物学过程的关键基因。

　　4.、10XGenomics单细胞平台有什么优势？

　　一.细胞通量高，一次可捕获上万细胞 ；

　　二.对细胞大小及类型限制低，且捕获效率高达65% ；

　　三.性价比高，且从悬液到文库构建周期短。

　　5、如何判定数据质量？

　　拿到一个高质量的数据，第一步是需要获得高质量的单细胞悬液。单细胞悬液的细胞活性，要求大于80%。目前常用的是AO/PI染色和台盼蓝染色法。相比较而言，台盼蓝染色会有一定的假阴性。针对用台盼蓝染色做的植物原生质体的活性测定，假阴性的比例会更高。因为富含叶绿体的植物细胞在台盼蓝染色后颜色更深，细胞计数仪会被判定为死细胞。因此，经验丰富的操作人员检查细胞状态，也是非常重要的一步。第二步是需要捕获到足够数量的高质量的细胞。关于这一点的质控标准，可结合下图做个阐释。

　　1、捕获到的细胞数量：这是单细胞测序研究的重要参数。捕获到的细胞数量越多，证据越充分，越有利于发表高分文章。在后续分析过程中，会再做一次细胞过滤，最终得到的细胞数目，即是每一篇单细胞测序文章都会描述的捕获到的细胞数目。

　　2、是细胞中的平均reads数，相当于测序深度，一般大于3万是比较好的数据。

　　3、是细胞中的中位基因值，该值的大小与不同的组织样本有关，如癌细胞中可能数值较高。

　　4、是测序的饱和度，一般大于50%即可。

　　5、是本次测序得到的reads比对到高质量细胞的占比，也是后续用来分析的数据。如果细胞活性偏低，细胞破裂较多，游离到环境中的mRNA偏多，这个数值会偏低。

　　6、如何判断细胞类型？

　　细胞类型的判断是需要您自己选择Marker基因的，您可以参考同类物种或样本的已发表文章，或者根据数据库去确定Marker，比如CellMarker，panglao等。

　　细胞是生命活动的基本单位，而如今科技的发展让我们有能力有机会去对它进行探索，去一展它的全貌，去窥探复杂生命背后的深层机制，我们相信在未来较长的一段时间内，随着单细胞测序的发展及数据的积累，关于表型、基因型与环境之间的脉络会越来越清晰，让我们能更加深入的了解自然了解自己。