原代细胞复苏技术

. 原代细胞冻存复苏技术简介
在ELISPOT检测的应用中，往往需要用到冻存的淋巴细胞样品作为检测细胞。由于ELISPOT检测的是细胞的免疫功能，不仅仅需要保持细胞的存活率，而且还要保证细胞的功能不发生变化。传统的细胞冻存方法通常是为了保存细胞株，对细胞存活率的要求不高，更没考虑保持细胞原有的免疫状态，所以传统的细胞冻存方法已经不能满足ELISPOT检测的要求。参见图7.1。
考虑到ELISPOT检测的特殊性，荷兰U-CyTech公司经过精心的研究与反复的验证，推出了Cryostar™冻存试剂盒，在冻存液中添加了一系列对细胞有特殊保护作用的保护剂。达科为公司在接到Cryostar™冻存试剂盒之后，在我们的实验室以及国内数家客户的实验室做了细胞冻存与复苏的实验，并且对复苏之后的细胞做了ELISPOT检测。结果表明，淋巴细胞的存活率超过90%，ELISPOT斑点形成频率与新鲜细胞完全相同。
2. 细胞冻存、复苏的标准程序
l 实验仪器：
    ² 可控温度细胞离心机离心机；
    ² 血球计数板或者自动细胞计数设备； 
    ² 细胞程序降温盒Nalgene “Mr. Frosty”；
    ² -70°C冰箱；
    ² 液氮罐；
    ² 37°C水浴锅。
l 耗材准备
    ² 15ml圆锥底聚丙烯（PP）离心管； 
    ² 无菌的原代细胞冻存管，2ml，外螺旋；
l 试剂配制
    ² 热失活补体胎牛血清； 
    ² R0培养基：RPMI-1640培养基，含谷氨酰胺，加入1%双抗，不加血清。
    ² 达优®无血清培养基：已经含有谷氨酰胺和双抗，打开即用。
    ² Cryostar™重悬液(Cryostar™ Resuspension Medium)：含有细胞冻存保护成分，-20°C长期保存，4°C可以保存6个月。
    ² Cryostar™ 2×冻存液（Cryostar™ Freezing Medium）：含有原代细胞冻存保护成分以及DMSO，-20°C长期保存，4°C可以保存6个月。