原代细胞的复苏步骤

  细胞一般储存在液氮中,温度达196°C ,理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以zuida限度的
保存细胞活力。
细胞复苏就是要把原本冷冻保存(冻存)着的细胞恢复到一般的生长状态,今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。
一、检查
收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有请立即处理告诉寄方。细胞株请尽速开始培养, 或立即冷冻保存(置于-70
。C ,隔夜后,移到iq N2)。

二、冷冻细胞解冻
1、依据细胞株说明书zhiding的基础培养基种类、血清种类和其它zhiding之成份和比例,制备培养基。
绝大多数之细胞均无法立即适应不同基础培养基或不同的血清种类,若因实验需要,必须有所不同时,务必以缓慢比例渐次改变培养基组
成，确定细胞适应后,方进行所需之实验。
2、FBS (fetal bovine serum,胎牛血清), CS (calfserum,小牛血清)和HS (horseserum,马血清) ,对细胞而言差异jida,请务必依据细胞株
资料zhiding的血清种类培养细胞。
3、将培养基置于37 °C水槽中回温,回温后喷以70 %酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37 °C水槽中快速解冻,
水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿,否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化后,以70 % ethanol擦拭冷冻管外部,移入无菌
操作台内。
4、依据细胞种类和浓度,于无菌操作台内取10 ml培养基加至T25或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液,缓缓加入T25或T75 flask内
之培养基,混合均匀,放入37°C , 5 % CO2培养箱培养。
5、对绝大多数细胞而言, 1 %以下之冷冻保护剂DMSO ,不会对细胞之贴附或活化有不良影响,不需立刻由解冻细胞中去除,待第二二天确 
定细胞生长或贴附良好后再去除即可。
对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞,需立即去除DMSO者,则可将解冻后之细胞悬浮液放入5- 10 ml培养基中,离心300
xg (约1000 rpm) , 5分钟,小心移去上清液,加入适量新鲜培养基,将细胞均匀混合后,转移至培养瓶中,再放入37°C, 5 % CO2培养箱培养

三、收到T25 flask细胞时的处理方式
1.于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡, T25 flask均加满培养基。请检查flask 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染
现象，若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。
2.将原封之T25 flask 静置于37。C，5 % CO2培养箱中,使细胞回温至37。C , 并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。
隔天后,于无菌操作箱内取出flask内之培养基, (取出之培养基可以再使用) ,仅留约5-10ml培养基于flask内,依-般培养方式再将细胞置
入培养箱中,或细胞已长满盘,则将细胞做传代培养。

四,细胞复苏注意事项
1、整个复苏过程尽量手脚麻利-些,战线拉得太长可能影响复苏效果;
2、由于“化冰”这一步里冻存管与水温差太大,尤其是液氮里来的冻存管,放到水里可能会造成翻江倒海的既视感,所以可以用镊子夹住
冻存管往水里摁,这样即使有炸裂的情况也会有水做缓冲;
3、取冻存管时要谨防冻伤,尤其是夏天,尽管热也zuihao穿长袖白大褂, -些不经意的动作可能会把你的小鲜肉“粘”到冰箱门上;
4、离心这-步也可以在冻存管里的冰融化后直接进行,也就是直接把冻存管离心,离心后弃去原来的冻存液,然后直接加完全培养基重悬
细胞,接着把细胞转到培养皿/瓶里培养。这种方法也许不能将DMSO清除得很干净,但是基本影响不大。
5、复苏第二天记得去看看细胞 ,如果状态还不错的话就说明复苏成功