试剂、试剂盒 封闭缓冲液封闭试剂抗体LB 顶层琼脂糖LB 平板琼脂培养基
仪器、耗材 硝酸纤维素滤膜λ噬菌体载体cDNA 文库
实验步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录 12。
将贮存液稀释到适当的浓度。
封闭缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V) Tween-20
封闭试剂 [1%(m/V）明胶，3%(m/V) 牛血清白蛋白，或 5%（m/V) 脱脂奶粉]
对于这些封闭实际的优点，不同实验室各执一词。我们建议使用者进行预试验确定哪种封闭液与所选择的第一抗体和第二抗体匹封最优。封闭液可以贮存于 4°C, 重复使用数次。加入叠氮化钠至终浓度为 0.05%(m/V) 用以抑制微生物的生长。
抗体
制备用于文库筛选的抗体
培养基
LB 平板琼脂培养基
每 90 mm 陪氏细菌培养皿需 30~35 ml 琼脂培养基。每 150 mm 平板需约 50 ml 琼脂培养基。平板必须干燥，否则，当硝酸纤维素滤膜取出时，顶层琼脂糖会被揭掉。通常，两天前制备的平板在使用前将盖略微揭开，在 37°C 溫育1~2 h, 效果很好。
LB 顶层琼脂糖
用前在微波炉中短时加热熔化顶层琼脂糖，然后冷却至 47°C。将熔化的顶层琼脂在无菌管中分成 3 ml 等份（90 mm 平扳）或 7.5 ml 等份（150 mm 平板)。将分好的等份放在 47°C 干燥器或水浴中以防止顶层琼脂凝固。
专用设备
硝酸纤维素滤膜
适合用于结合蛋白质及免疫印迹的包括无 Triton X-100 硝酸纤维素滤膜（Millipore HATF 或等同产品）和硝酸纤维素衍生支持物，如 Hjrbond-C extra[Amersham Pharmarcia Biotech 公司]。尼龙膜和带极性尼龙膜因为固定蛋白质的能力差且背景髙而不适用于免疫筛选。
附加试剂
本节步骤 1 需要第 2 章方案 1 所列试剂。
本节步骤 2 需要本章方案 1 所列试剂。
载体和菌株
λ噬菌体载体
利用表达载体和菌株构建所需 cDNA 文库
方法
1. 将非重组λ噬菌体铺在 10 块琼脂平板上，以得到半融合裂解的菌苔（请见第 2 章方案 1)。
2. 按方案 1 步骤 5~12 所述，但略去 IPTG 处理，制备硝酸纤维素滤膜上的裂解菌苔印痕。
不必按方案 1 步骤 8 所述标记滤膜。
3. 用封闭液以 1:10 稀释用于筛选的抗体制剂。
4. 将滤膜与稀释的抗体共同溫育 6 h。在处理后的抗体中加入 0.05% 叠氮化钠，保存于 4°C 以备免疫筛选时使用。
稍加修改后，该方法即可用于细菌菌落的候筛选以去除抗大肠杆菌抗体可以在硝酸纤维素滤膜上固定一些不含有插入 cDNA 表达载体的细菌菌落（请见方案 2）。然后按方案 2 步骤 10~16 进行细胞裂解及洗膜。最后，按上述步骤 3 和 4 处理抗血清。