双光子共聚焦显微镜

双光子共聚焦显微镜是为了解决生物检测中样品染料标记的光漂白现象而提出的，因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，这样就要求激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色（即光漂白现象），荧光信号会随着扫描进程的进行变得越来越弱。除此之外，还有光毒作用问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。针对活性样品的研究，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象将使这些研究受到很大的限制。

　　双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个较低能量（即更长的波长）的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个能量较高（即波长为长波长一半）的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子共聚焦显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

　　双光子共聚焦显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子共聚焦显微镜比普通共聚焦显微镜更适合用来观察厚标本、活细胞，或用来进行定点光漂白实验