双向凝胶荧光染色与成像实验

试剂、试剂盒：

提取液                                                                  

洗涤液                                                                 

溶解液                                                                 

第一向电泳缓冲液                                                                  

还原溶液                                                                  

烷基化溶液                                                                 

琼脂糖溶液                                                                  

丙烯酰胺凝胶溶液 

仪器、耗材：

双向凝胶电泳                                                                  

光扫描仪或密度计

实验步骤：

3.1 可溶性总蛋白的提取方法（三氯乙酸/丙酮法）

( 1 ) 从拟南芥细胞悬浮培养液中收集细胞。

( 2 ) 液氮中研磨细胞。

( 3 ) 向研磨好的细胞粉末中加入提取液，在 -20℃ 放置至少 30 min ( 见注释 7) 。

( 4 ) 42000 g 离心以除去不溶物，用洗涤液（见注释 8 ) 清洗 3 次 （见注释 8)。

( 5 ) 将管子放置在空气中使其干燥。

( 6 ) 在溶解液中振荡沉淀 2 h 溶解蛋白（见注释 9) 。

( 7 ) 根据 Bradford 法 [ 3，4] 测定蛋白浓度，使用等份样品和血清白蛋白作标准曲线 ( 等份样品是指相同比例的溶液）。

3.2 双向凝胶电泳

( 1 ) 直接用第一向电泳溶液相匹配的 100 μg 蛋白质溶液水化 IPG 胶条（18 cm，pH 4.0~7.0) 。

( 2 ) 进行等电聚焦直至 100 kV/h。

( 3 ) 进行第二向电泳前，在还原液中将蛋白质还原后再用烷化液将蛋白质进行烷基化处理，两者各 15 min。

( 4 ) 将胶条用琼脂糖溶液包埋在 11% 的丙烯酰胺胶的顶端。

( 5 ) 在电泳缓冲液中进行 SDS-PAGE，每块胶 15 mA，10°C 过夜（见注释 10)。

3.3 CCB 染色和成像（见注释 11、注释 12)

根据 Neuhoff 等的方法对凝胶进行染色。每一步操作中，每块胶使用 300 ml 溶液。所有操作均需振荡。

( 1 ) 将凝胶浸没在固定液中至少 2 h 或者过夜以固定蛋白。

( 2 ) 用水清洗凝胶三次，共 30 min。

( 3 ) 将凝胶转移到培育液中培育 1 h  ( 见注释 13)，然后再转移到染色液中（见注释 13、注释 14)。

( 4 ) 轻微振荡，在染色液中显影 5 天。

( 5 ) 用水清洗凝胶，用扫描仪在 300 dpi 分辨率下获取图像（图 14-1)。


3.4 SN 染色和成像（见注释 11、注释 12)

根据 Mortz 等 [15] 的方法对凝胶进行染色。每一步操作中，每块胶使用 300 ml 溶液。所有操作均需振荡。

( 1 ) 将凝胶浸没在固定液中至少 2 min 或者过夜以固定蛋白质。

( 2 ) 用洗涤液清洗凝胶 3 次共 20 min。

( 3 ) 在敏化液中短时间浸泡凝胶（2 min) ( 见注释 15)。

( 4 ) 用水清洗凝胶 3 次，5 min。

( 5 ) 在染色液中浸染凝胶 20 min。

( 6 ) 用水快速清洗凝胶 2 次 共 1 min。

( 7 ) 将凝胶放入显色液中 5~10 min  ( 见注释 16)。

( 8 ) 在终止液中终止显色 5 min 后将凝胶转移到贮存液中。

( 9 ) 使用扫描仪在 300 dpi 分辨率下获得图像（图 14-1)。

3.5 SR 染色和成像（见注释 11、注释 12 和注释 17 )

每一步操作中，每块胶使用 300 ml 溶液。所有操作均需振荡。

( 1 ) 将凝胶浸没在固定液中 30 min 以固定蛋白。

( 2 ) 凝胶在染色液中侵染至少 30 min ( 最多 1 h ) 。

( 3 ) 用洗涤液清洗凝胶 30 min。

( 4 ) 使用带 473 nm 激光激发和长通道滤光镜 Y510 的 FLA-5000 分析仪获取图像。选择条件为 100 μm 分辨率、16 位灰度、光电管电压 700 V ( 图 14-2 )。



3.6 DP 染色和成像（见注释 11、注释 12 和注释 17)

每一步操作中，每块胶使用 300 ml 溶液。所有操作均需振荡。

( 1 ) 将凝胶浸没在固定液中 1 h 以固定蛋白。

( 2 ) 用水清洗凝胶 4 次，每次 10 min。

( 3 ) 凝胶在染色液中浸染 1 h。

( 4 ) 用洗涤液 1 清洗凝胶 2 次、10 min，然后再用洗涤液 2 清洗 2 次，10 min。

( 5 ) 使用带 532 nm 激光激发和长通道滤光镜 0575 的 FLA-5000 分析仪获取图像。选择条件为 100 μm 分辨率、16 位灰度、光电管电压 700 V ( 图 14-2) 。

3.7 C16-F 染色和成像（见注释 10、注释 11、注释 17 和注释 18)

根据 Kang 等 [27] 的方法对凝胶进行染色。每一步操作中，每块胶使用 300 ml 溶液。所有操作均需振荡。

( 1 ) 将凝胶浸没在固定液和染色液中对蛋白同时进行固定和染色。

( 2 ) 用洗涤液至少清洗凝胶 2 次，每次 5 min。

( 3 ) 使用带 473 nm 激光激发和长通道滤光镜 Y510 的 FLA-5000 分析仪获取图像，选择条件为 100 μm 分辨率、16 位灰度、光电管电压 700 V  ( 图 14-2) 。

3.8 染料间的比较

以上染色方法中，当上样为 100 μg 拟南芥组培细胞中提取的总可溶性蛋白时，CCB 通常可检出 250 个蛋白质点，C16-F 可检出 450 个蛋白质点、DP 可检出 550 个蛋白质点、SN 可检出 600 个蛋白质点、SR 可检出 800 个蛋白质点（图 14 -1 和 图 14-2) 。表 14-1 中总结了这些方法的主要特征。根据染料类型、染色步骤和操作时间对染色方法进行了比较。图像质量通过背景效果、点饱和度和染料敏感度进行了评价。