双向电泳仪技术性能与发展

双向电泳仪有两向电泳组成，第一向根据蛋白质的等电点不同在pH梯度凝胶中进行等点聚焦，第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行SDS－PAGE电泳。双向电泳仪可以将2000～3000种蛋白质进行分离。

一、蛋白质组学研究：

1、蛋白质组：

蛋白质组是指一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质。

2、蛋白质组学：

蛋白质组学是指研究蛋白质组的技术和这些研究所得到的结果，包括蛋白质鉴定、翻译后修饰及蛋白质功能与疾病的关系。

3、蛋白质组学研究的意义：

蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达变化或差异分析将具有重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生命现象的本质奠定基础。

4、蛋白质组学研究所面临的困难：

（1）细胞种类的多样性。

（2）细胞的生命周期。

（3）蛋白质生成的时效性。

（4）蛋白质的结构和变异。

（5）研究方法。

5、双向电泳的重要性：

原位细胞提取与样品处理－双向电泳－质谱的技术路线是一条典型的蛋白质组学研究的技术路线。

双向电泳是研究蛋白组学的关键技术，是深刻认识蛋白质结构和功能的重要工具。

二、双向电泳工作原理：

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D－PAGE）是结合等电聚焦电泳（根据蛋白质等电点进行分离）和SDS－PAGE电泳（根据蛋白质的大小进行分离）而形成的二维电泳，是分离分析蛋白质最有效的电泳手段。

通常第一向电泳是等电聚焦电泳，在细管中（Ф1～3mm）中加入含有载体两性电解质、8M的脲酶和非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。然后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30min，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液，使其固定并与浓缩胶连接。在第二向电泳中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离。

三、双向电泳主要步骤：

双向电泳是一项技术性很强并且很辛苦的工作。

1、样品准备。

2、第一向形成pH梯度进行等电聚焦电泳。

3、第二向进行SDS－PAGE电泳。

4、考马氏亮兰染色或银染色。

5、肉眼观察或自动扫描，进行电泳图分析。

四、双向电泳存在的问题：

1、重复性差：方法尚未标准化，导致不同实验室之间的结果难以重复。

2、定量困难。

五、双向电泳的进展：

1、双向平板电泳的进展：

（1）染色试剂有考马氏亮兰、银染、同位素和荧光等。

（2）由染色检测到直接紫外检测。

（3）肉眼观察到自动扫描。

2、由双向平板电泳到双向毛细管电泳（双向柱电泳）：

（1）第一向为毛细管等电聚焦电泳。

（2）第二向为毛细管区带电泳。

3、由双向平板电泳到双向芯片电泳。

4、由双向平板电泳到多维电泳。