双向电泳检测长春新碱诱导肿瘤细胞凋亡时蛋白质的变化

【原理】

IEF/SDS-PAGE双向电泳法1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/SdS-PAGE双向电泳。其中IEF电泳（管柱状）为第一向，SDS-PAGE为第二向（平板）。在进行第一向IEF电泳时，电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。IEF电泳结束后，将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液（内含SDS、β-巯基乙醇）中振荡平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端，即可进行第二向电泳。

IEF/SDS-PAGE双向电泳对蛋白质（包括核糖体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。

【试剂与器材】

1. 垂直平板电泳槽

2.电泳仪

3.微量进样器

4.7号长针头（长10cm）和注射器

5.凝胶贮液：丙稀酰胺（Acr）30g、双丙烯酰胺（Bis）0.8g，ddH2O溶解，定容至100ml。

6.0.05MpH8.0Tris-HCI缓冲液：0.61gTris加入50mlddH2O使之溶解，再加入3ml1MHCL溶液，混匀后在pH计上调pH至8.0，最后加ddH2O定容至100ml。

7.分离胶缓冲液：Tris36.3g加入1MHCI溶液48.0ml，再加ddH2O到100ml，pH8.9。

8.电极缓冲液：3gTris、14.4g甘氨酸、lgSDS，ddH2O定容至1000ml。

9.样品缓冲液：l.0ml甘油、0.lml巯基乙醇、100mgSDS、2mg溴酚蓝、2mlTris-HCI缓冲液，ddH2O定容至10ml。

10.过硫酸铵（AP）溶液：lgAP溶于10mlddH2O中（要求现用现配）。

11.四甲基乙二铵（TEMED）：lmlTEMED加ddH2O至100ml，置于棕色瓶中4℃保存备用。

12.染色液：1.25g考马斯亮兰R-250，溶于500ml固定液中，混匀。

13.脱染液：75ml冰醋酸、50ml甲醇、875ml水，混匀。

14.标准蛋白（高分子量）

15.浓缩胶缓冲液：Tris5.989加1MHCI溶液48.0ml，加ddH2O到100ml，pH6.7。

16.固定液：取50％甲醇454ml，冰醋酸46ml混匀。ICE-PAGE双向电泳

17.两性电解质Ampholine，pH3~10，浓度40％。

18.正极缓冲液：0.2％（V/V）硫酸或磷酸。

19.负极缓冲浪：0.5％（V/V）乙二胺水溶液。

【操作步骤】

1. 将细胞以4.0×108/L密度接种于用12孔培养板中，每孔3mL，37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁，加入长春新碱，使之终浓度分别为0、10、100μg/mL。继续培养过夜。弃去培养基，以冷PBS(pH7.2)洗涤细胞，每孔加入100μL细胞裂解液,用细胞刮刮下细胞，-20℃放置20min,将裂解液收集于1.5mL的EP管中，冰上超声破碎细胞（10s/次×3次，间隔15s），4℃，12000×g离心5min，收集上清液，蛋白质样品与等体积2×上样buffer混匀，煮沸5min，紫外分光光度法测定蛋白质浓度（A215/A225）。立即上样或将样品保存于-20℃备用。

2.取10μg细胞裂解提取物，加入双向电泳上样缓冲液(9.7gUrea、5.5gAmpholytes、1.45gDTT、300μl0.01kg/L溴酚蓝、44.9mlH2O)。等电聚焦于18000V/h后，取下胶条，稳压下进行10％SDS-PAGE第二向电泳。

3．将PAGE胶取下银染，分析。