第二阶段 筛选一个相互作用子
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释至适当的浓度
二甲基亚砜（DMSO)
乙醇
可选择，请参见步骤 9。
冻存转化体用的无菌甘油溶液
65% 无菌甘油
0.1mol/LMgS04
25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
TE(pH7.5)（无菌）
TE(pH7.5)，含 0.1mol/L 乙酸锂
TE(pH7.5), 含 40%PEG4000 和 0.1mol/L 乙酸锂（无菌）
核酸和寡聚核苷酸
载体 DNA
剪切处理的鲑精 DNA 为典型的常用载体。髙质量的 DNA 是非常重要的。使用低质量的制品可能降低 1~2 个数量级的转化频率。生产髙质量鲑精 DNA 的简便方法请参见 Schiestl 和 Gietz(1998) 的方法和第 6 章方案 10, 也可选择许多公司出售的这种商品。
相互作用筛选文库
培养基
CM 选择培养基
利用表 18-3 估计所需培养基的量，根据表 18-8 制备所需的选择培养
无氨基酸的酵母 (YNB) 分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表 18-8 中假定 YNB 中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它躭不含有硫酸铵，配制时每升培养基中应加入 5 g 硫酸铵。
酵母选择 X-gal 培养基
1. 按照表 18-8 在 900 ml 水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至 55°C。
2. 在另一个瓶于中，将 7 g 磷酸氢二钠和 3 g 磷酸二氢钠溶于 100 ml 蒸馏水中，高压灭菌。
3. 将两种髙压灭菌溶液混合在一起，加入 0.8 ml 浓度为 100 mg/ml 的 X-gal(格于 N,N-二甲基甲酰胺), 铺制平板。
离心机和转子
Sorvall GSA 转子或等同物
Sorall RT6000 离心机和 H1000B 转子或等同物
专用设备
选择培养基用培养极（24 cmX24 cm)(见表 18-3)
这些培养板非常昂贵，但是可以重复使用很多次（见步骤 9)。
Falcon 管（50 ml，无菌）
玻璃珠（直径 0.45 mm, 无菌；Sigma)
可选，请见步骤 9。
加热块，预设至 42°C
微量滴定板（96 孔）
可进，请参见步骤 21。
多道移液器或接种多支管/蛙形器（例如 Dankar Scientific)
可选，请参见步骤 21。
用于多菌落转移的蛙形器可以购买或自己制造也很容易；蛙形器的所有辐条都有一个平坦的表面且辐条末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通过高压或乙醇灼烧来灭菌。
载体和细菌菌株或酵母菌株
携带表达诱饵蛋白质和 lexAop/lacZ 报道子的载体的酿酒酵母候选菌株（来自第—阶段）。
方法
转化文库
1. 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子的酵母菌落，接种于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中，30°C 摇动过夜培养。
重要：应该在用文库重新转化之前 7~10d 内，将诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子质粒转化到酵母中。在整个试验过程中始终保持无菌条件非常重要。
2. 稀释 20 ml 的过夜培养物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中，以使稀释后培养液的 OD600 约为 0.10~0.15。在旋转摇床上 30°C 摇动培养，直到该培养物增殖 1~5 倍，OD600 达到 0.50 左右。
3. 把培养物转移至 1 个 250 ml 的无菌离心瓶中，室温下 1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 转子 2500~3000r/min) 离心 5 min。移去上清，加入 30 ml 无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至 1 个 50 ml 的无菌 Falcon 管中。
4.1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 转子 2500~3000r/min) 离心酵母细胞 5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于 1.5 ml 含 0.1mol/L 乙酸锂的 TE(pH7.5) 中。
5. 在 30 个 1.5 ml 的无菌小离心管中分别加入 1ug 的文库 DNA 和 50ug 刚刚变性的载体 DNA。马上在每个小离心管中加入 50ul 的酵母悬浮液（来自步骤 4)。
—个成功的转化试验，每微克文库 DNA 应该产生约 105 个转化子。使用小体积的 DNA(最好毎个转化管中少于 10ul) 通常可以提高转化效率。
平行地进行多份小量的酵母转化有利于喊少污染的概率，而且这种方法与在较少试管中采用较大体积相比，经常可以得到显著更髙的转化效率。每份感受态酵母细胞悬泮液中不要加入过多的转化文库 DNA, 否则每个感受态细胞可能吸收多个文库质粒，使后面的分析复杂化。
6. 在每管细胞悬浮液中加入 300ul 含 40%PEG4000 和 0.1 ml/L 乙酸锂的无菌 TE(PH7.5), 轻轻翻转试管若干次使混合（不要振荡)，30°C 培养 30~60 min。
7. 每个试管中加入 40ul DMSO, 翻转混匀悬浮液，在 42°C 的加热块上加热 10min。
8. 按照下述步骤将转化混合物铺平板：
其中的 28 管只用于产生转化子
a 把每管中的混合物加到 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上。