| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 第一阶段 诱饵-LexA 融合蛋白的鉴定 |
方法
诱饵-LexA 融合蛋白的构建
1.将编码诱饵蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合载体（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为 pBait。
2. 采用下列 LexA 融合基因和报道质粒的组合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌：
a.pBait+pMW112(活化测定）
b.pSH17-4+pMW112(活化的阳性对照）
c.pRFHMl+PMW112(活化的阴性对照）
d.pBait+pJK101(抑制/DNA 结合测定）
e.pRFHMl+pJK101(抑制的阳性对照）
f.pJK101单独（抑制的阴性对照）
每种质粒功能的描述，请见表 18-1 和 18-2。
3. 将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(针对质粒组合 a~e) 或 CM(Glu)-Ura(针对质粒组合 f)。将培养板在 37°C 培养 2~3d 以选择含有质粒的转化酵母克隆。
如果克隆在 3~4d 内没有出现，或只有很少量的克隆（<20), 则应重新转化。
4. 制备转化子的母板，从中可按步骤 5~9 描述的那样，对具有 lacZ 和 LEU2 报道子活化表型的特异性克隆进行分析。
活化和抑制活性的鉴定：X-gal 和 Leu2 表型的分析
步骤 5~9 用于测试诱饵-LexA 融合蛋白质的转录激活性，并证实诱饵的融合物不影响 DNA 结合活性（抑制分析的图示请见图 18-9)。对步骤 2 中转化的每种质粒组合，挑选几种单个克隆做分析。这对于某些诱饵的构建非常重要，因为蛋白质表达水平在不同克隆中会有变化，正如活化两种报道子转录激活的表观能力有变化一祥。在第一阶段结束处的替代方案中，给出了一种替代步骤 5~8 的、通过氯仿交叠分析来测试活化的方法。
5. 从 a~f 的每个转化（取自步骤 2) 中，用无菌的平头牙签挑选约 8 个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 板上的小格内成为 lcm 长的线。通常可在一个板上形成多达 60~80 条线。将平板在 30°C 孵育过夜。
6.第二天，从两个母板中再划线到下列每个板上：
转化 a~f: 划线到 CM(Glu,X-gal)-Ura 和 CM(Gal，X-gal)-Ura 上
转化 a~c: 划线到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上
7. 在 30°C 将平板孵育到 4d。
8. 对抑制和激活性进行分析；
a. 对于抑制活性，在划线接菌约 12~24 h 时观察 X-gal 表型。
b. 对于激活性，在划线接菌 18 h 到 72 h 之间观察 X-gal 表型。
c. 在 48 h 到 96 h 之间观察 Leu2 表型。在表 18-7 中给出了具有良好表现的诱饵所应得的预期结果，并总结如下。
（1）最好在接种到 CM(Gal,X-gal)-Ural2~24 h, 应当能看出 d+e 转化比 f 的颜色浅。
在接种到 CM(Glu，X-gal)-Ura 48 h,b 转化应当是亮蓝色,c 应当是白色，而 a 应当是白或很淡的蓝色。
（2）在接种后 48 h, 在 CM(Glu)-Ura-His-Leu 或 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上，b 转化应当同在 CM(Glu)-Ura-His 母板上一样很好生长，而 a 和 c 应当不生长。
（3）最理想的是,a 转化在接种后 96 h 内仍没有明显的生长。
9.基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。
检测诱饵蛋白质表达
10. 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用（在第二阶段中）。
11. 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子（如 pRFHMI)。
a. 用无菌牙签从 CM(Glu)-Ura-His 母板上挑取克隆，于 CM(Glu)-Ura His 液体培养基中生长。如果带手套，牙签可落入培养管并留在那里，不用担心污染。
b. 在滚筒或其他摇动仪器上 30°C 培养过夜。
c. 早晨，将达饱和的培养液稀释到含 3~5 ml CM(Glu)-Ura-His 的新培养管中，使初始密度 OD600 约为 0.15。30°C 培养 4~6 h, 直到光密度大约增大两倍（OD600 约 0.45~0.7)。
