nverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多,而Inverse-PCR一般只要有特异条带,基本上就是目的片段。
基本步骤如下:
1、反向PCR(Inverse PCR)原理:反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。
a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界(左边界、右边界均可)和酶切位点附近设计引物P1、P2;
b. 回收DNA,T4连接酶连接,使酶切后的DNA片段环化;
c. 回收连接后的DNA,用引物P1、P2做PCR,就可扩增到两端为T-DNA插入序列,中间为侧翼序列的片段。
2、限制性内切酶消化:选择合适的限制性内切酶,基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组DNA定量。
根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组DNA,酶切体系如下:
Buffer for EcoR I | 2μl |
Genomic DNA | 3μl |
EcoR I | 0.5μl (10u/μl) |
ddH2O | 14.5 μl |
20μl |
37度 过一夜,电泳检测酶切效果。
3、回收DNA
① 将酶切产物转到1.5ml离心管中,用ddH2O洗涤干净,并稀释到250μl;
② 加入等体积的酚和氯仿(V:V=1:1),涡旋混匀,室温静置1min;
③ zui大速度(13, 000 rpm)离心1min;
④ 将上清移到另一管中,加入等体积的氯仿,涡旋混匀,室温静置1min;
⑤ zui大速度(13, 000 rpm)离心2min;
近期,安图生物先后获国家药品监督管理局、河南省药品监督管理局颁发的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原检测试剂盒(磁微粒化学发光法)、抗线粒体M2抗体IgG检测试剂盒(磁微粒化学发光法)、人CYP2......
为便于供应商及时了解政府采购信息,根据《财政部关于开展政府采购意向公开工作的通知》(财库〔2020〕10号)等有关规定,现将山东省公共卫生临床中心(省胸科医院、济南市传染病医院)2024年02(至)1......
2月3日,新华社受权发布的《中共中央国务院关于学习运用“千村示范、万村整治”工程经验有力有效推进乡村全面振兴的意见》(简称《一号文件》),对生物育种产业化提出了新的要求和期待。文件明确提出,要推动生物......
全球动植物种质资源鉴定评价及确权交换中心项目-综合测试基地建设用地面积约200亩,其中规划可建设用地面积约21.6亩。包括新建一级测试圃六万余平方米,二级测试圃(二级隔离网室及温室)三万平方米,三级测......
山东大学荧光定量PCR仪采购招标项目的潜在投标人应在山东大学采购网(http://www.cgw.sdu.edu.cn/)获取招标文件,并于2023年12月22日14点30分(北京时间)前递交投标文件......
近日,忻州市市场监督管理局批准发布《PCR实验室医疗废弃物处置规程》。2023年10月13日发布,2023年12月13日开始实施。1、范围本文件规定了PCR实验室医疗废物处置的术语和定义、处置程序、技......
2023年11月1日,沈阳市第六人民医院发布《辽宁省传染病医疗救治中心一期附属配套工程医疗设备招标公告》项目公告,预计花费14447460.00元采购医疗设备。详细信息如下:一、项目基本情况项目编号:......
项目编号:54000023210200015746项目名称:西藏大学学科建设能力提升计划项目青藏高原多源固废资源精炼与循环利用研发中心(二)预算金额:280万元(人民币)小型低电压透射电子显微镜采购1......
4月12日,中国科学院北京生命科学研究院赵方庆团队在《自然-实验手册》(NatureProtocols)上,发表了题为Full-lengthcircularRNAprofilingbynanopore......
传染性细菌和病毒,如严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)、埃博拉病毒、SARS-CoV-2、登革热病毒、肺结核等,给人类健康带来了灾难性的后果和威胁。......