实验方法原理 |
反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。 |
---|---|
实验材料 | DNA样品 |
试剂、试剂盒 | T4 DNA连接酶(T4 DNALigase) 引物 EcoR I ddH2O 酚 氯仿 无水乙醇 乙酸钠 |
仪器、耗材 | 电泳仪 离心管 离心机 超净台 水浴锅 |
实验步骤 |
一、限制性内切酶消化 1. 选择合适的限制性内切酶,基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组DNA定量。 2. 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组DNA,酶切体系如下:
1. 将酶切产物转到1.5 ml离心管中,用ddH2O洗涤干净,并稀释到250 ul; 2. 加入等体积的酚和氯仿(V:V=1:1),涡旋混匀,室温静置1 min; 3. 最大速度(13 000 rpm)离心1 min; 4. 将上清移到另一管中,加入等体积的氯仿,涡旋混匀,室温静置1 min; 5. 最大速度(13 000 rpm)离心2 min; 6. 将上清移到另一管中,加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,0.1倍体积的3 M 乙酸钠(pH=5.2),轻轻振荡混匀,室温静置5 min; 7. 4℃最大速度(13 000 rpm)离心10~15 min; 8. 弃上清,尽量除去管壁上的液体; 9. 加入1 ml -20℃预冷的70%乙醇,轻轻颠倒几次。最大速度(13 000 rpm)离心5 min; 10. 除去乙醇,在超净台上平放,将管壁上的乙醇挥发掉,20~40 ul ddH2O溶解。-20℃保存。 三、连接
2-14℃ 过夜 2. 连接体系比较大,而DNA含量比较低,不需加入PEG4000,这样可以促进分子内的连接,减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等(2002)的方法(12-14℃连接48 h)。连接完成后,65℃ 水浴10 min灭活。按上述3.抽提回收,溶解于40 ul ddH2O中。
3. 然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
展开 |
注意事项 |
1. 需要从许多酶中选择合适限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。 2. 基因组DNA必须酶切完全。 3. 为提高分子间连接的效率,连接反应中DNA的浓度要低,因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平,从而产生非特异性扩增。 4. 成环的cDNA进行裂解和变性比较重要,因为环状双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应,它只可以扩增出较短的DNA片段。 5. 碱变性法已成功地用于制备PCR和测序DNA,该方法也可以有效地使环化的双链cDNA实现变性。
展开 |
为便于供应商了解采购信息,根据《物资服务集中采购需求管理暂行办法》等有关规定,现将的采购意向公开如下:采购项目名称:业务相关仪器设备采购项目。序号需求概况预算金额(万元)预计采购时间1采购内容:气相色......
PCR检测——ISO标准发布近日,由上海海关主导制定的2项ISO标准正式获得国际标准化组织(ISO)通过并发布。这两项ISO标准是:《ISO/TS20224-10:2024分子生物标记分析——食品和饲......
近期,安图生物先后获国家药品监督管理局、河南省药品监督管理局颁发的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原检测试剂盒(磁微粒化学发光法)、抗线粒体M2抗体IgG检测试剂盒(磁微粒化学发光法)、人CYP2......
为便于供应商及时了解政府采购信息,根据《财政部关于开展政府采购意向公开工作的通知》(财库〔2020〕10号)等有关规定,现将山东省公共卫生临床中心(省胸科医院、济南市传染病医院)2024年02(至)1......
2月3日,新华社受权发布的《中共中央国务院关于学习运用“千村示范、万村整治”工程经验有力有效推进乡村全面振兴的意见》(简称《一号文件》),对生物育种产业化提出了新的要求和期待。文件明确提出,要推动生物......
全球动植物种质资源鉴定评价及确权交换中心项目-综合测试基地建设用地面积约200亩,其中规划可建设用地面积约21.6亩。包括新建一级测试圃六万余平方米,二级测试圃(二级隔离网室及温室)三万平方米,三级测......
山东大学荧光定量PCR仪采购招标项目的潜在投标人应在山东大学采购网(http://www.cgw.sdu.edu.cn/)获取招标文件,并于2023年12月22日14点30分(北京时间)前递交投标文件......
近日,忻州市市场监督管理局批准发布《PCR实验室医疗废弃物处置规程》。2023年10月13日发布,2023年12月13日开始实施。1、范围本文件规定了PCR实验室医疗废物处置的术语和定义、处置程序、技......
2023年11月1日,沈阳市第六人民医院发布《辽宁省传染病医疗救治中心一期附属配套工程医疗设备招标公告》项目公告,预计花费14447460.00元采购医疗设备。详细信息如下:一、项目基本情况项目编号:......
项目编号:54000023210200015746项目名称:西藏大学学科建设能力提升计划项目青藏高原多源固废资源精炼与循环利用研发中心(二)预算金额:280万元(人民币)小型低电压透射电子显微镜采购1......