反相离子对色谱仪分析常用的流动相是甲醇－水、乙腈－水，流动相中一般含有3～10mol/L的离子对试剂。
流动相pH值决定离子化合物的解离度，合适的pH值是反相离子对色谱的重要条件。为了使化合物zui大程度的解离，获得合适的保留和响应，又不超出硅胶基质色谱柱的承受范围，一般流动相pH = 2～7.5。
强酸性样品在低pH值能充分解离，对流动相pH值要求不严。对于弱酸性样品需在高pH值时才能充分解离，若pH值过低，则抑制解离，样品组分呈不解离溶质，故这些样品不太适合采用pH值分析。
碱性样品的分析可控制在较低pH值，能在色谱柱适应的范围内较方便的进行反相离子对色谱分析。