反转录病毒产毒细胞系建立实验

包装细胞系

HEPES CaCl2 甘油 DMSO

培养皿 培养板 离心机

1.  在转染前1天，在10 cm 培养皿中接种包装细胞，接种密度大约相当于10%~20%片的细胞数。

2.  将10 μg 含有药物抗性基因的反转录病毒质粒DNA加入0.5 ml HeBS。再加入32 μl 2 mol/l CaCl₂并同时轻轻摇晃。用手指轻弹试管外壁约 30 s，然后在室温下温育45 min，直到形成细小的淡蓝色沉淀。

3.  移去包装细胞的培养液，吸取HeBS-DNA沉淀轻轻加在培养皿的中央。在组织培养操作橱内让细胞接触DNA 20 min，大约10 min 后，轻轻转动培养皿以均匀分散DNA溶液，加10 ml 培养液，将细胞置于37℃温育4 h。

4.  吸尽培养液，轻轻加入2.5 ml 室温的HeBS/甘油溶液。将培养血放回培养箱中温育3.5 min 或90 s，或对于特定细胞经测定的合适的温育时间。快速弃除HeBs/甘油溶液，细胞用10 ml 培养液轻轻清冼， 重复用培养液清洗1次，加5 ml 含有血清的培养液，培养18~24 h。

5.  移出培养液，用0.45 μm的滤器过滤，获得的上清含有短暂产生的病毒；将其贮存于 -70℃或-80℃，或者立即用于感染另一个带有不同类别的包膜基因的包装细胞系， 以产生一个被感染的产生病毒的细胞系。
 

6.  在转染的细胞中加10 ml 培养液，培养2~3天，然后继续步骤10。

7.  在感染前1天，将包装细胞系按1：10至1：20传代。

8.  移去将要感染的包装细胞系的培养液。加病毒如下：用于感染一个10 cm 的培养皿上的细胞，稀释0.1~1.0 ml 毒原液至终体积3~5 ml 并加800 μg/ml 的polybrene至8 μg/ml；如感染一个6 cm 的培养皿，稀释0.1~1 ml 病毒原液至终体积2 ml，并加800 μg/ml  的polybrene至终浓度8 μg/ml 温育1 h。

9.  对于10 cm 培养皿则，加培养至终体积10 ml，对于6 cm 培养皿则加4 ml。培养2~3天。

10.  在转染或感染后2~3夭，将转染的或惑染的细胞按1：10或1：20传代， 加选择培养液，培养3天。换新的选择培养液，再培养4~7天直至可见到细胞克隆。

11.  用克隆圆柱体挑取分隔良好的细胞克隆，每个克隆转移至2个24孔培养板或6孔培养板的培养孔中。生长至50%~90%汇片。

12.  移去培养液，换成1/2体积的培养液。视包装细胞系不同而培养1~3天，移出培养液，立即对其进行直接滴定，或贮存于-70℃或-80℃。

13.  继续传代各产病毒细胞克隆，直至其可冻存，和（或）直至鉴别出最好的产病毒细胞。当鉴定出一个好的产病毒细胞克隆时，细胞分装在20~25支冻存管（1~2 ml 每支） 中，培养液含10%~50%DMSO，在液氮中冻存。

1.  如果转染的目的是为了生成稳定的产病毒细胞系，有两种选择。第一种选择是从那些已经稳定整合了载体质粒的转染细胞中进行选择。这些细胞可置于药物选择之下，对产生的药物抗性细胞进行产毒筛选。第二种选择是用“交叉感染”的包装细胞系。上述第5步中收集到的短暂产生的病毒可用来感染另一个包装细胞系，如步骤7~9。其后被感染的包装细胞可置于药物选择之下。无论用哪种方法，目的都是为了分离稳定整合了病毒基因组并产生可能的最高滴度的包装细胞。

2.  这个方法较用转染的细胞方法可能更受次迎，因为由感染而产生的前病毒常常是与宿主基因组稳定地联系并在整合后不发生重排或丢失。用这种方法时必须用表达不同类别的病毒糖蛋白的两种包装细胞系，当一个包装细胞系产生一种持定的env搪蛋白时，该包装细胞的表面的受体就被那种病毒糖蛋白结合而被阻断。当用交叉感染时，两种包装细胞系必须是同源的。