反转录病毒原液检测实验

病毒细胞

polybrene 小牛血清 DMEM

培养皿 滤膜

1.  在开始分析的前1天，按1：50将NIH 3T3细胞分传于3个6 cm 培养皿中。将1个培养皿标记为阳性对照，1个为阴性对照，1个用于待测病毒原液。

2.  含有选择标记的待测病毒的制备：加0.01 ml 800 μg/ml polybrene至1 ml 待测病毒上清中，通过0.45 μm 滤器过滤。

3.  含有选择标记的阳对照的制备：制备1 ml 无辅助病毒的病毒原液与10~100 CFU辅助病毒原液的混合液。加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通过0.45 μm 滤器过滤除菌。

4.   阴性对照病毒原液的制备：制备1 ml 无辅助病毒的病毒原液，加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通过0.45 μm滤器过滤除菌。

5.  用各病毒原液感染培养皿上的细胞。将感染后的3个培养皿置于37℃ CO₂培养箱中温育1~3 h以利于吸收，加4 ml DMEM-10培养至细胞汇片。

6.  将细胞按1：50分传于新的6 cm 培养皿中。3个培养皿中每个仅传一个培养皿，弃去原来感染的细胞的无用的部分。使polybrene的终浓度在2 μg/ml 培养至细胞长到50%~90%汇片。

7.  弃去培养液换以半量的新鲜DMEM-10。再培养2~3天。

8.  收获生长汇片的细胞的最终的上清。经0.45 μm 滤膜过滤，加polybrene至终浓度8 μg/ml。保存于-70℃~ -80℃，或立即用于滴定及分析标记抗性。

9.  在上清滴定前1夭，将新鲜的未经感染的NIH 3T3细胞按1：10或1：20分传于3个6 cm  培养皿中。用各种上清1 ml 感染口NIH 3T3细胞，并进行滴定的各步操作。如果出现了几千个neo抗性的克隆就说明原始的待测病毒原液中污染了辅助病毒。