古朵技术：细胞裂解提取蛋白的步骤

  在实验过程中，我们常常需要证明实验组相对于对照组某些蛋白质是多了还是少了，那么我们就需要先把细胞或组织中的蛋白质提取出来进行测量，今天就给大家介绍一下细胞与组织蛋白质提取的基本知识和步骤。

    蛋白样品制备的原则：

    1.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失；

    2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解；

    3.样品裂解液应新鲜制备，并分装存于-80℃，勿反复冻融已制备好的样品；

    4.通过超速离心清除其余杂质。

    一般的理解方法分为温和的裂解方法和剧烈的蛋白裂解方法。

    温和的裂解方法

    用于组成比较简单的样品，或分析某一特定的细胞器。

    （1）渗透裂解：血细胞、组织培养细胞

    （2）冻融裂解：细菌、组织培养细胞；液氮冻融

    （3）去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物；用于组织细胞

    （4）酶裂解细胞：植物、细菌和真菌等含有细胞壁的细胞

    剧烈的蛋白裂解方法

    常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞。

    （1）超声波裂解法：细胞样品

    （2）弗氏压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞；常用于含有细胞壁的微生物、藻类

    （3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于液氮中，随后研磨成粉末

    （4）机械匀浆法：

    （5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破细胞壁；用于细胞悬液或微生物

    那么蛋白提取的步骤来了：

    所需器材：低温高速离心机，匀浆搅拌器，超声仪，真空泵，细胞挂勺等。

    所需试剂：RIPA裂解液，蛋白酶抑制剂（PMSF）,无菌PBS等。

    蛋白样品提取

    1、细胞蛋白的提取：

    1.根据实验需要取出需要提取的细胞培养板，置于冰上，用吸引器吸除上清液。PS：所有操作均应在在冰上进行。

    2.每孔细胞（六孔板）中加入 1-2ml 4℃预冷的PBS溶液。平放轻轻摇动十秒钟清洗细胞，然后吸除洗液，共清洗洗细胞三次（目的是去除剩余的上清液），后一次不吸除上清液。

    3. 用刮勺将细胞轻轻刮下，接着用移液器将细胞和上清液转移至1.5ml离心管中，置入4度离心机（提前开离心机预冷），离心1.5min，弃去上清液。

    4.配置裂解液（所用裂解液为RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分释放），每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）。PS：PMSF属于蛋白酶抑制剂，可以减少蛋白质的讲解，另外的蛋白酶抑制剂还可以用cocktail，NaF，NaN3等，也可以同时加入多种蛋白酶抑制剂。

    5.将配置好的裂解液加入第3步获得的细胞沉淀中，一般5*10^6个细胞加入100ul的裂解液，然后吹打重悬，使细胞充分裂解。

    6.用超声仪进一步裂解细胞：将细胞放置于冰上进行超声，一般功率选择为15%左右，裂解时间为1分钟（超声2s，休息4s），当超声一次后，离心管仍比较浑浊，可以间隔几分钟再次超声。

    7.超声结束后，将细胞于4度离心机，12000rpm离心 25min。

    8.将离心后的上清分装转移至1.5ml 离心管，保存于－80℃备用。

    2、组织中总蛋白的提取：

    1.将少量组织块置于 1.5ml离心管中，加入500ul含PMSF的强RIPA裂解液，先用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，当组织较软时（如脑组织），接着用1ml枪头不断地吹打吸取，然后用匀浆器进一步打碎组织，后用超声仪进行超声裂解；当组织较韧时（如肌肉组织），可以直接用匀浆器打碎组织，后用超声仪进行超声裂解。（裂解组织就是通过不同的方法让组织块不断变小）。

    2.同上方法，将离心管置入 4度离心机，12000rpm离心25min，取上清分装于1.5ml离心管中并置于－80℃保存。