叶绿体的分离与荧光观察

实验概要

本实验介绍了叶绿体分离的基本原理及操作步骤。有助于了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

实验原理

叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/  min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。

主要试剂

1. 蒸馏水

2. 0.35mol/L氯化钠溶液

3. 0.01%吖啶橙

主要设备

1. 普通离心机

2. 研钵

3. 天平

4. 荧光显微镜

5. 载玻片

6. 盖玻片

7. 镊子

8. 恒温箱

9. 培养皿

10. 滤纸

11. 试管及试管架

12. 移液管

13. 滴管

14. 烧杯

15. 离心管

实验材料

菠菜叶片

实验步骤

1. 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。

2. 利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3-5min，或研磨成匀浆。

3. 用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

4. 取滤液4mL在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

6. 沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。

7. 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。

8. 观察叶绿体的形态结构、叶绿体发射荧光的现象。