叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作川就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。

实验目的

一、通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。

二．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．井熟悉荧光显微镜的使用方法。

实验原理

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差迷离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗  粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5mia，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。

荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荣光．若停止供能荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。

实验用品

一、器材

1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。

2、小型器材，500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。

二、材料    新鲜菠菜

三、试剂    0.35mol/L氯化钠溶O.01%吖啶橙(acridine orange)。

实验方法

1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。

2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3—5min。

3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。

5、将上沾液在3000r/min下离心5rmin．弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。

6、将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。

7、取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

①在普通光镜下观察。
②在荧光显微镜下观察。
③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。

菠菜叶手切片观察    用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。

①在普通光镜下观察。
②在荧光显微镜下观察。
③用同样方法制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。

实验结果

一、叶绿体的分离和观察

1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

2、以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。

3、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。

二、菠菜叶手切片观察

1、在普通光镜下可以看到三种细胞

(1)表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。
(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
(3)叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。

叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

2、在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。

3、用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。