叶绿体的分离与观察实验原理和实验操作

实验原理

将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

实验用品

(一) 材料新鲜菠菜或其它植物叶片

（二）器材 普通离心机、组织捣碎机、扭力天平、光学显微镜、500m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、10m1 刻度离心管20 支、纱布若干、载玻片和盖片等。
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易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

（三）试剂0.35mol/L NaCl 溶液。

实验操作

1. 游离叶绿体的制备与观察

（1） 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。

（2）利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。

（3）将匀浆液用200 目尼龙网或6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。

（4）取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。

（5）将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。

（6）将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。

（7）取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。

2. 组织中叶绿体的观察

取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。

观察结果

1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

2. 表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈无色。

3. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。

4. 叶脉导管呈螺纹状。

5. 保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。

6. 气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。