叶绿体的制备及其对染料的还原

实验概要

分离与纯化叶绿体的方法，了解细胞器的一般分离程序及叶绿体的光还原活性。

实验原理

细胞或组织和分离介质混匀，经破碎匀浆后用差速离心法，经几次不同转速可以获得不同的细胞器。离体的完整具有光合活性的叶绿体的制备就是采用这种方法。
  被分离的离替叶绿体是否具有光合活性，可以用不同的方法来鉴定，对染料（2-6—二氯酚酊粪）在光下还原作用是其中的一个方法。                                       光e-                                                      ↓ H2O 氧化型染料（兰色）→→  O2 还原型染料（无色）
  所以我们通过染料和离体叶绿体混合液在照明光前后，染料颜色上变化可以鉴别被分离的叶绿体的活力。
  叶绿体是比较大的细胞器，在叶肉细胞中含量丰富，用新鲜的植物叶片匀浆后使用普通离心机进行离心也能得到良好的分离效果。
  叶绿体酶系对热敏感，在室温下容易失活，因此，提取叶绿体全部过程必须保持在冷的条件下。这样在实验中所需的基本仪器和药品都必须保存在冰箱中，而且整个操作过程都应在0-4oC条件下完成。  

主要试剂

[1].STN缓冲液：0.4M蔗糖，0.01M NaCl, 0.005M MgCl2, 0.05M溶解于三羟甲基胺基甲烷（Tris）—HCl缓冲液，调pH到7.6。       称取6.06gTriS，136.9g蔗糖，0.58gNaCl，0.29gMgCl2 加入蒸馏水750ml混合后用1N HCl调节pH至7.6，然后用蒸馏水稀释到1L。      
[2].1×10-4  M ３-(3,4-二氯苯)-1，1二甲基脲（DCMU）。      
[3].2.5×10-4 M 2.6-二氯苯酊酚，：称取二氯苯酊酚72mg，溶解于1L蒸馏水中，在黑暗条件下保存。      
[4].冰块   

主要设备

显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、离心机、瓷研体、盘式天平、剪刀、纱布、玻璃漏斗、烧杯、量筒、玻璃棒、滴管、吸水纸、分光光度计、水浴锅、。

实验材料

新鲜的菠菜叶

实验步骤

（一）叶绿体的制备。    1、菠菜叶片洗净吸干表面水滴，贮在4℃冰箱中备用。    2、取10ml分离介质（STN缓冲液）分两次放入研钵中。    3、去掉叶柄和主脉，称取5克叶片并把叶片剪称1－50px2小块和介质一起在钵中研磨，研磨成匀浆为止。    4、将匀浆用二层纱布过滤到烧杯中。    5、滤液用1000rpm离心8分钟，弃去沉淀，留上清。    6、上清液中加入介质5ml，混匀，再以1000rpm 离心8分钟，弃去沉淀，留上清。    7、上清液用2500rpm离心10-20分钟，弃上清液，留下沉淀的叶绿体小球。    8、加入适量冷却的STN缓冲液，将沉淀的叶绿体全部悬浮，将叶绿体悬浮液一起贮存于冰箱中。    9、转移出0.5ml叶绿体悬浮液到另一只干净试管中，在60℃水浴中保持5分钟，然后取出试管，贴上标签再贮存于冰箱中。    10、分别在两张载片上各滴一滴加热和未加热的叶绿体悬浮液，并用盖片盖起来，在油镜下观察这两种叶绿体的形态。
（二）叶绿体对染料还原作用。    

     1.取出没有加过热的叶绿素悬浮液试管，充分振荡，以便全部叶绿素呈均匀的悬浮状态，然后取0.1ml叶绿素悬液，加4.9mlSTN缓冲液混合倒入一个干净的比色管内，用这支不含染料的叶绿体比色管作对照， 校正分光光度计零点。    2.象前面那样再次摇匀没加过热的叶绿体悬浮液试管，再取0.1ml加到试管2中，摇匀后倒入另一支干净得比色管中，放在分光光度计比色管内立即读出吸光率，波长为600µm。    3.把这个2号管的比色杯放入盛水的100ml烧杯中，调节比色杯和60W光源距离为250px，然后打开电源，准确照光1分钟，再一次立即读出吸光率。如此反复测定5-10次，并以曲线表示。     4.再取0.1ml没有加过热的叶绿体悬浮液加入管3中，用管1校正分光光度计，按步骤2到4，反复这个程序，并记录每次数据，为了减少比色管的误差，可使用同一比色管，每次换溶液时，倒出原来管内溶液，用蒸馏水连续清洗几次，并用吸水纸吸去比色杯内残留的水分，将结果永曲线表示。