叶绿素的理化性质测定实验

实验方法原理：叶绿素是一种二羧酸的酯，可与碱起皂化作用，产生的盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都具有共轭双键，在可见光区表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子后转变成的激发态叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，可以发出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质也很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。叶绿素分子中的镁可被H+所取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇到Cu2+可形成绿色的铜代叶绿素，这种叶绿素在光下不易受到破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸制标本。

实验材料：

菠菜叶                                                                  

木瓜叶

试剂、试剂盒：

95﹪酒精                                                                  

KOH甲醇溶液                                                                  

醋酸                                                                  

苯                                                                  

醋酸铜粉                                                                  

碳酸钙                                                                  

石英砂  

仪器、耗材：

天平                                                                 

分光镜                                                                  

小电炉                                                                  

试管                                                                  

量筒                                                                  

移液管                                                                  

研钵                                                                  

小烧杯                                                                  

漏斗等

实验步骤：

1. 叶绿体色素提取

称取新鲜叶片2g剪碎于研钵中，加少量95﹪酒精（或80﹪丙酮）和少量CaCO3粉及石英砂，研磨成匀浆，再加95﹪酒精（或80﹪丙酮）l0ml稀释研磨后，用滤纸过滤于小瓶中，滤液即为叶绿体色素提取液。

2. 叶绿素的皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

（1） 用移液管吸取叶绿体色素提取液约5ml放入试管中，再加入1.5ml左右20﹪KOH甲醇溶液,充分摇匀。

（2） 片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），静置试管架上，可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化叶绿素a和b（以及少量叶黄素），上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

3. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用

（1） 吸取叶绿体色素提取液约5ml放入试管中，加入30﹪醋酸数滴，摇匀，观察溶液颜色的变化。

（2）当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉，微微加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜的一管相比较。

（2）解释上述颜色变化过程，并列出其反应式。

4. 叶绿素的荧光现象

取比较浓的叶绿素提取液5ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光

的颜色有何不同？试述其原因。

5. 光对叶绿素的破坏作用

（1）取两支试管，各加入经稀释的叶绿体色素提取液5ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗处，1～2 h后观察二管溶液颜色有何变化。

（2） 另取上述实验Ⅰ中用纸层析法分离成的色谱两张，一张放在直射光下，另一张放在黑暗中。约1 h以后比较两张色谱上四种色素的颜色各有何变化。

（3） 解释以上结果。