吉林大学：利用CRISPR／Cas9构建转基因猪

　　来自吉林大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统高效构建出了myostatin (MSTN)基因突变猪。这一研究成果发布在11月13日的《Scientific Reports》杂志上。吉林大学的逄大欣(Daxin Pang)教授及焦虎平（Huping Jiao）是这篇论文的共同通讯作者。

　　开发定制核酸内切酶技术可推动构建出转基因动物，利用它们来探究基因功能及生成人类遗传疾病模型。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9可在特异位点导入DNA双链断裂，然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组来进行修复。通常，NHEJ修复过程可在双链断裂区域造成小删除或插入基因突变。由于高效且具备快速装配能力，在这三种核酸内切酶技术中CRISPR/Cas9成为一种更强大的工具。当前，研究人员利用CRISPR/Cas9系统已成功构建出了斑马鱼、果蝇、小鼠和猴等许多的转基因动物。

　　Myostatin (MSTN)作为TGF-β超家族的一员，在肌肉生长中发挥负调控因子作用，其为改善家畜生长性能带来了巨大的希望。相比野生型小鼠，MSTN基因敲除(KO)小鼠显示出更结实的肌肉群，一些MSTN自然突变的牛品种也显示更结实的肌肉群。以往的一些研究显示，在进化过程中猪MSTN基因与牛和羊MSTN经历不同的选择压力。有可能MSTN在猪中呈现不同的表达模式或起不同的作用。猪是世界上最重要的家畜之一，猪肉在中国的消费量尤其大。因此，构建出MSTN基因敲除猪对于调查其对肌肉发育和产肉性能的影响意义重大。

　　以往的研究报道称，通过将Cas9 mRNA和sgRNA胞质注射到受精卵内，或利用抗生素选择的成纤维细胞进行体细胞核移植(SCNT)来生成基因靶向猪。但这两种方法都有缺点。共同注射Cas9 mRNA和sgRNA到受精卵中会生成具有多种表型的嵌合动物，且需要耗费时间和成本完成进一步的猪繁殖工作。来自药物选择成纤维细胞的遗传工程猪往往携带着抗生素耐药基因，它们正日益受到生物安全性关注。

　　在这篇新文章中，吉林大学的研究人员报告称他们将猪胚胎成纤维细胞(PFFs)的转染效率提高了接近90%，由此提高了靶向载体的突变效率。他们还证实了CRISPR/Cas9系统可在猪胚胎成纤维细胞MSTN位点诱导NHEJ、长片段删除/倒置及同源指导修复(HDR)。

　　最后，研究人员通过体细胞核移植利用无选择标记基因的Cas9/gRNA改造的成纤维细胞生成了基因靶向猪，获得了了MSTN双等位基因突变8只克隆小猪。一些小猪显示明显的肌间沟及大舌头，这是双肌(DM)表型的特征。相比于对照，突变克隆猪的MSTN蛋白水平下降，他们还对MSTN的mRNA水平和相关信号通路因子进行了分析。最后，研究人员仔细评估了克隆猪中的脱靶突变。

　　作者们表示，新研究中所采用的基因编辑平台可以高效地生成生物安全性转基因猪。