含有目的基因真核表达pEGFPC1载体的构建实验_质粒提取

质粒提取试剂盒限制性核酸内切酶

离心机振荡培养箱电泳装置冰盒恒温水浴箱

1.  挑取含有目的DNA重组体的单个菌落接种在3 ml LB（含有Amp或Kan）液体培养基中，37 ℃，225 rpm培养12～16 hrs。

2.  提取质粒

⑴离心菌液，废弃上清。

⑵加入250 ul Buffer P1，使菌片重悬，务必使片状物不可见。

⑶加入250 ul Buffer P2，上下颠倒EP管4～6次，操作时间要少于5 min。

⑷加入350 ul BufferN3，上下颠倒EP管4～6次，可见絮状沉淀。

⑸离心13000 rpm，10 min。

⑹离心后的上清液移入PrepSpinColumn。

⑺13000 rpm离心30～60Secs，弃滤液。

⑻加入0.5 mlBufferPB，13000 rpm离心30～60 Secs，弃滤液。

⑼加入0.75 mlBufferPE，13000 rpm离心30～60 Secs，弃滤液。

⑽13000 rpm再离心1 min，弃滤液。

⑾将PrepSpinColumn加到新的1.5 mlEP管上。

⑿加50 ul BufferEB至滤膜中央，室温静置1 min，13000 rpm离心1 min。即获得所需质粒。

3.  酶切鉴定

反应体系（20 ul 体系）：
 

反应条件：37 ℃ 2-3 hrs

4.  电泳：观察酶切结果。