哈佛大学尹鹏NatureBiotechnology：高灵敏度单细胞质谱流式

　　利用质谱仪计数单细胞

　　质谱仪使用金属同位素标记的抗体标记感兴趣的靶点，这使得能够同时测量数百万个单细胞中的约50种蛋白质或蛋白质修饰，从而能够分析高度异质性样品中复杂的细胞行为。然而，目前的质谱分析灵敏度有限，通常需要将数百种金属标记抗体结合到每种细胞表位上，才能达到仪器的检测阈值。这阻碍了用于分析低丰度蛋白质组成分的质谱仪的发展，包括许多转录因子、表面受体蛋白和细胞内磷酸化位点，这些成分在健康和疾病中起着重要作用

　　在质谱仪中放大信号的一种方法是增加金属抗体的化学计量比，但迄今为止这一直是一个挑战。现有的信号放大方法在用于质谱仪的实施中面临技术困难。例如，酪胺信号扩增（TSA）和碱性磷酸酶介导的扩增都应用酶偶联抗体来催化靶蛋白周围的信号积累，但这些方法引入了高非特异性信号，不允许多路复用。滚环扩增（RCA）利用环状DNA快速合成检测寡核苷酸链的杂交位点。通过在环状DNA中设计正交DNA序列，RCA在单细胞RNA定量中实现了高度复用。然而，当与基于抗体的检测相结合时，RCA反应往往会受到非特异性背景抗体结合的影响，从而产生高强度的假阳性信号。此外，分子拥挤性通常会影响RCA反应中的扩增效率。在杂交链式反应（HCR）中，可以诱导荧光标记的DNA单体在与抗体结合的靶DNA引物上组装。然而，HCR的多路复用限制使得同时测量多个蛋白质表位变得困难。

　　新型信号放大策略

　　在这项研究中，哈佛大学尹鹏等人提出了一种信号放大技术，称为循环延伸扩增（ACE）。该技术结合了基于3-氰基乙烯基咔唑亚磷酸酯的DNA交联，实现了基于热循环的DNA原位连接，从而能够在>30个蛋白质表位上同时进行信号放大。研究证明了ACE在悬浮质量细胞术低丰度蛋白质定量中的实用性，可表征上皮到间充质转化以及间充质到上皮转化过程中的分子重编程。作者展示了ACE量化人类T淋巴细胞信号网络反应动力学的能力。此外，作者也进一步介绍了ACE在基于质谱细胞术的多参数组织成像中的应用，以识别多囊肾组织中与病理状态相关的组织隔室和轮廓空间方面的差异。相关工作以“Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry”为题发表在Nature Biotechnology。

　　【文章要点】

　　作者团队之前开发了交换反应信号放大（SABER）方法（Nat. Methods 16, 533–544 (2019)），该方法使用预合成的DNA连接物产生信号放大。使用正交放大器序列，Immuno-SABER可以顺序测量数十个蛋白质表位。然而，将免疫SABER应用于悬浮质谱细胞术以放大金属离子信号一直很困难，因为去除成像样本中非特异性结合物所需的严格洗涤条件不能应用于悬浮细胞。此外，在飞行时间质谱分析之前的高温单细胞液滴蒸发步骤中，DNA双链体是不稳定的，这会损害免疫SABER的扩增能力。为此，在本文中，作者创建了一种信号放大方法，其中结合在抗体上的DNA条形码在热循环条件下进行重复的原位延伸，产生多个检测寡核苷酸结合位点的拷贝。通过使用九聚体短DNA条形码作为标记在抗体上的引发剂，减少了非特异性结合（图1）。

　　图1 ACE原理图及其应用

　　为了实现更高效的质谱分析中，作者还还引入了基于3-氰基乙烯基咔唑亚磷酰胺（CNVK）的核酸光交联方法，促进扩增DNA结构实现质谱分析样品引入所需的高热稳定性。研究证明，循环扩展放大（ACE）策略可以在信噪比不受影响的情况下实现500倍以上的信号放大。研究验证了33个正交ACE序列，平均信道间串扰为1.07%。应用32参数ACE面板来分析小鼠Py2T细胞上皮间质转化（EMT）和研究较少的间质上皮转化（MET）过程中的分子特征，并发现Zeb1和细胞周期蛋白B1之间的表达比率可以作为细胞经历MET的标志（图2）。

　　图2 ACE用于细胞计数信号扩增的验证和定量

　　此外，作者还同时扩增了30个T细胞受体（TCR）信号标志物，以全面分析1小时刺激过程中人Jurkat T细胞和原代人CD4+T细胞中的TCR信号网络。对TCR网络动力学对患者术后引流液（POF）共刺激反应的深入分析揭示了组织损伤引起的免疫抑制T细胞特征。将ACE与基于IMC的组织成像相结合，以分析人类肾组织的结构组织和表型异质性，作者分析概括了肾皮质的六个主要区室，并揭示了多囊肾病中一种干性标志物巢蛋白的异质表达水平。总之，ACE提供了一种解决质谱分析中灵敏度挑战的方法，使单细胞中低丰度蛋白质组底物的分析成为可能（图3）。

　　图3 ACE能够在单细胞分辨率下实现全面的TCR信号网络分析

　　结论与展望

　　最后，作者指出， ACE的一些局限性需要在未来的工作中加以改进。目前的ACE反应需要使用清洁剂Triton X-100来渗透细胞。在基于ACE的信号扩增之前，细胞表面蛋白必须按照兼容的方案进行染色。低丰度蛋白质组的分析受到当前抗体可用性的限制。应用ACE无法改善抗体特异性差导致的低信噪比。然而，对于细胞内标记物，特别是存在良好抗体的转录因子和信号蛋白，与传统的质量细胞术方法相比，ACE的灵敏度和准确性大大提高。因此，该方法特别适用于在常规质谱分析中几乎检测不到或无法检测到的低丰度标记。