哺乳动物精核的制备实验

实验方法原理

实验材料 哺乳动物组织培养细胞（如 HeLa 细胞）

试剂、试剂盒 PBS裂解缓冲液缓冲液 B

仪器、耗材 带有 B 型研磨棒的杜恩斯匀浆器光学显微镜

实验步骤

1. 培养并收获 3L 1×106 细胞/ml 的哺乳动物组织培养的细胞（如 HeLa）， 用 1L PBS清洗两次。

2. 用 20 倍于沉淀体积（40 ml） 的裂解缓冲液重悬细胞沉淀，转移到杜恩斯匀浆器中，用 B 型研磨棒研磨 15 次以裂解细胞。在显微镜下观察裂解液。

3. 4℃，3000 g 离心 15 min。

4. 使用裂解缓冲液重复重悬及离心两次，再用缓冲液 B 重复一次。在最后一次离心之前，将重悬液用 2 mol/L NaCl 稀释 10～30 倍，测量 A260 值，估计核 DNA 的总量。

5. 用 2 倍于沉淀体积的缓冲液 B 重悬得到的核，测量重悬液的总体积。

6. 轻轻搅动，一滴一滴地加入 1 体积的缓冲液 B/0.6 mol/L KCl/10％ （ V / V ） 甘油。

4℃ 连续轻轻搅动 10 min。如有需要轻轻匀浆。

7. 4℃， 17 500 g 离心回收精核 30 min。精核在液氮或干冰中速冻，并且可在 -80℃ 储存一年以上。