哺乳动物细胞的RNAi技术策略(1)

目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，以下是有关 i技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略，主要来自于《遗传》杂志2005年“ 干涉（i）技术应用于哺乳动物细胞的研究策略”，希望能给从事或者准备从事 i相关实验的研究人员以帮助。
一、靶si 序列选择
靶si A序列选择是 i实验成败的关键。哺乳动物细胞 i实验中，使用最广泛且最有效的是21bp si 。si 由正义链和反义链组成，两条链3’端均有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。
1. si 设计的原则
Si 双链设计时，一般在靶m 起始密码下游100―200bp至翻译终止密码上游d0―100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3’端相邻19个核苷酸作为候选si. 靶位点。其中AA（N19）TT是最理想的序列，若靶m 中无此序列，亦可选用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成时，si 的正义链3’端需用dT―dT代替。TuscRl等建议设计的si 不要针对m 的5’和3’端非编码区，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP（si protein complex，核酸内切酶复合物）结合m ，从而影响si 干扰的效果。最后还应将候选si 序列在GenBank进行BLAST检索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。
2. 高效si 的序列结构特征
除了靶序列位点的选择，siI 序列本身结构特征亦会影响到 i效率。 i实质上可视为一个与蛋白质互作过程，包括si 与RISC结合、RISC的激活以及RISC与靶m 的结合和切割，这种互作效应的存在，往往造成si 链的选择具有偏爱性。Reynolds等通过对2个基因的180条si 序列分析，归纳出以下8个与
si 高效性相关的特征:G/C含量低(30%-52%)，正义链3’端具较低稳定性（有利于si 与RISC的结合和解链），无反向重复序列（有利于减小si 的有效作用浓度，提高si 干扰效率），正义链碱基的偏爱性A19（正义链中第19位碱基为A，如下表示类同）；A3；U10；无G/C(正义链中第19位碱基不为G或C)；无 G13。依此规则，Reynolds等设计的30条si 中有29条是有效的。Kumiko等亦认为si 反义链5’端为A/U（即有义链U/A）19和最后7个碱基中有5个A/U，会有助于 i的高效发挥，且正义链G/C1和序列中无连续9nt以上的GC重复片段与基因沉默效率呈显著相关。有趣的是，该实验还表明这些规则同样适用于DNA介导的 i（DNA-based i.）实验。此外，Amarzguioui等发现正义链5’与3’端的前3个碱基中A/U含量不对称(3’端含量应高一些)和A6对si 的活性亦影响很大。根据上述结果，可以初步绘制出一个高效si 序列结构的精细与简略示意图。

现已知道si 的反义链决定着靶位点识别，那么在不影响si 作用功效的前提下，是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢？Amarzguioui等研究si 不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性，认为si 的5’端相对于3’端具有对突变的较高耐受性。有学者认为正义链3’突出端的任何碱基修饰对si 作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链3’端发生1―4个碱基的错配反而有助于增强 I的活性。
二、si 制备方法
目前为止较为常用的5种制备si s的方法包括
化学合成
体外转录
长片断ds s经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
si 表达载体或者病毒载体在细胞中表达si s
PCR制备的si 表达框在细胞中表达
前面3种方法包括体外制备si s然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达si s的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法，其实取决于实验目的。这里简单介绍这5种方法，优点和缺点，以及它们最适合的应用。
si 的设计
除了方法3以外，其他的方法都在制备si 前都需要单独设计si 序列。关于怎样设计si 以及si 设计对si 功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。但这仍然不是精确的。通常来说，每个目标序列设计3―4对si s，在后面的实验中选择最有效的那个。网上有提供免费的si 设计工具。
体外制备