四唑盐（MTT）比色实验——MTT法

活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490  nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 

细胞

D-Hanks液牛血清RPMI1640双抗0.08%胰酶

净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管玻璃瓶培养瓶废液缸吸头枪头胶塞离心管量加样枪红血球计数板

一、接种细胞

1.  用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞。

2.  用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液。

3.  以每孔10³～10⁴个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 ul。

二、培养细胞

1.  将培养板移入CO₂孵箱中。

2.  在37℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）

三、呈色

1.  每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 ul，37℃孵箱中继续孵育4 h。

2.  终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。

3.  对于悬浮生长的细胞，需离心（1000 rpm，5 min），然后弃去孔内培养液。

4.  每孔加入150 ul DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。

四、比色

1.  选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

2.  以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。

1.  选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。

2.  避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。

3.  设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。