固相化pH梯度双向凝胶电泳实验1

鼠肝

二硫苏糖醇（DTT)抽提溶液苯甲基硫酰氟（PMSF)

液氮低温离心机研钵和研杵

1.取一些肝放入研钵中，如果事先没有被冰冻，可用液氮充满研钵来保持肝冰冻。用研杵将肝破碎成小块。

2.称量冰冻肝的小块 10~40 mg，将其转移至在冰上放置的离心小管中。操作应迅速以尽可能减少肝样品的解冻。将剩余的肝储存在一 80°C。

3.在有肝样品的离心管中，每 40 mg 肝加入 1ml 冷的抽提溶液。每 1ml 抽提溶液加 100 mmol/L PMSF。

4.用小研杵（其大小适合在离心管中使用）磨碎肝样品。

5.每 1ml 抽提物中加 50ul 1.2mol/L DTT，振荡。

6.在 4°C 对样品进行最大速度离心，lOmin。

7.检测上清的蛋白质浓度。

8.将上清分成每 100ul —份。若不立即用于 IEF，将其储存在一 80°C(样品只能冻融一次，以避免多次冻融造成的不利影响）。

9.按照方案 5 进行第一向 IEF。

进行第一向 IEF 时，以鼠肝为例，浓度应为 5~lOmg/ml。对第一向 IEF，样品可在包含 7mol/L 脲、2mol/L 硫脲、20 g/LASB-14 的水化液中被稀释成准确浓度。但是，若在水化的同时上样，IEF 胶条可负载相当大体积的样品。最适水化溶液可根据蛋白质来源和经验而灵活决定。