固相化pH梯度双向凝胶电泳实验6

蛋白质通过 IEF 进行分离之后，可进行第二向电泳，即 SDS-PAGE。本方案详细介绍了灌制均一 SDS-PAGE 凝胶的方法。均一凝胶（具完全相同的%T和％c) 对特殊分子量范围的蛋白质有较好的分离效果，因其灌制方法简单而被普遍使用。

第二向凝胶可按三种不同方式（如尺寸）方便地制备：小胶用于 7 cmIEF 第一向凝胶；标准胶用于 11 cm、13 cm 以及 18 cm IEF 第一向凝胶；大型胶用于 18~24 cm 的 IEF 第一向凝胶。这些凝胶所用的试剂见下述，但在设备上要求不同。

如果凝胶用银氨方法染色，凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色的背景水平（方案 11)(HochstrasserandMerril，1998, 见表 4.5 的注释）。

过硫酸铵（10%)正丁醇乙醇4X凝胶缓冲液凝胶储存液单体胶储液SDS (10%)5XSDS 电泳缓冲液TEMED

凝胶灌制设备玻璃平板磁力搅拌子磁力揽拌器吸管隔片真空瓶水抽真空泵或其他真空装置

1.安装玻璃板之前，用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板，以确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。

实验提示：处理玻璃板的过程中要戴手套，以减少角蛋白和其他蛋白的污染。

2.对齐两块玻璃板，在两边放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔片。

3.用恰好足够的压力将两块玻璃板及隔片夹住，使其保持在适当的位置。将其底部立于水平面上，保证两块玻璃板底边及隔片相互齐平，锁紧夹子。

玻璃板的底边和隔片相互齐平是很重要的，这能降低灌制胶时泄漏的可能性。

4.将装配好的夹子装人灌胶架，转动旋钮以使胶框（即夹在一起的玻璃板和隔片）卡紧于支架的塑胶条上。

5.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部，不要用标记笔，因其会溶出渗入凝胶。

6.用不脱色记号笔在玻璃平板外面离上沿约0.5 cm 处作标记。

7.在灌胶之前将水加人凝胶框来确定凝胶溶液的体积。在灌胶前从凝胶框中除去全部的水，否则凝胶中丙烯酰胺的浓度会受影响。在真空瓶中配制准确体积的凝胶溶液（由表 4.5 计算），TEMED 和过硫酸铵的体积忽略不计。

8.在溶液中加一个小磁力搅拌子，用水抽真空泵抽几分钟以除去溶液中的空气，在磁力搅拌器上搅拌溶液。

虽然并非所有研究者都进行抽空气这步，但为了更佳的重复性，建议进行此步操作。

9.在瓶中加 TEMED 和过硫酸铵，轻轻搅拌至混合，不要产生气泡。

10.用吸头缓慢加入凝胶 (从一个角落滴加），加至距上沿 0.5 cm。

11.立即在凝胶上方加一薄层（100~500ul) 水饱和的正丁醇以避免凝胶暴露在氧气中，并且可使凝胶表面平整。

实验提示：第二向胶的表面应该很平，这样可更好地与第一向凝胶接触。许多研究者用双蒸水作覆盖液，但这样做可能会在凝胶上部稀释丙烯酰胺浓度。

12.让胶聚合至少 lh。

13.在聚合之后，检查每块胶是否完全聚合并且均一，同时检测胶的上表面是否水平。用双蒸水或去离子水清洗胶表面。

14.此胶可用于第二向电泳（方案 9)，并可在 4°C 储存两周。

储存的胶应用胶储液覆盖，并且用塑料膜紧密缠绕好。