国自然最新热点外泌体，你get到了吗？

1、  外泌体已成为生命科学/基础医学研究一大热点

2018 年国自然基金评审结果已尘埃落定，其中医学科学部共计有 9830 项获得了基金委资助。从数据来看，热门的几个方向依然火热：外泌体、非编码 RNA、表观遗传、肠道菌群、m6A、CRISPR/Cas9 技术等，其中，涉及到外泌体的研究项目 401 项，总资助经费 1.7 亿元。哈尔滨医科大学李悦教授「外泌体 miRNAs 介导细胞间应答网络调控心房代谢重构在心房颤动中的作用与机制」获得了重点项目资助。外泌体中标项目呈逐年增长的态势，其炙手可热的程度从科学网的统计数据可见一斑。

1）近 10 年外泌体相关基金项目年度中标量

2）近 5 年外泌体相关基金项目年度中标金额

2、何为外泌体，外泌体的生物学功能

外泌体是多泡体限制性膜与细胞质膜融合而释放的脂质双层膜囊泡，直径约 30～200 nm，电子显微镜下呈双凹碟形或杯状，外泌体能够运载其内源性的蛋白质、脂质、核酸、miRNA 等信息物质参与细胞间通讯和机体的生理代谢过程，被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体，在临床诊断和治疗方面展现出了极具前景的研究价值。外泌体通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，从而参与机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等生物学过程。外泌体的研究方向包括基础机制研究及临床应用研究，涉及肿瘤、免疫、代谢、神经调控等多个领域（参见以下外泌体学科中标情况）。

1）外泌体中标项目学科分布情况

3、  外泌体富集分离、鉴定、内容物分析

外泌体含多种蛋白，包括膜蛋白如 Tetraspanins 家族 CD9、CD63、CD81；细胞质蛋白如 Alix, TSG101, annexins, Rabs; 细胞骨架蛋白如 acins, myosins, tubulins; 分子伴侣如热休克蛋白（HSPs）；代谢酶如 enolases, GAPDH; 以及核糖体蛋白等。外泌体内还能包裹 mRNA、miRNA、lncRNA、mtDNA、circRNA 等核酸物质。外泌体所包裹的内容物具有细胞类型特异性，可转移至受体细胞并发挥生物学作用。

外泌体富集分离：外泌体在大小、来源和分子内容物方面均存在高度异质性，因此富集分离外泌体是开展其基础研究和临床转化应用的前提。传统经典的富集分离外泌体的方法有：超速离心、密度梯度离心、共沉淀、分子排阻色谱、不对称流场分离技术等。为了改进分离效率和特异性，新的方法也层出不穷，包括：微流体过滤、无接触分选、免疫亲和富集等。

基于物理特性鉴定外泌体的方法有：显微镜技术包括扫描电镜技术（SEM）、透射电镜技术（TEM）、冷冻电镜 (cryo-EM)、原子力显微镜（AFM）；动态光散射 (DLS)；纳米颗粒示踪分析 (NTA)；可调电阻脉冲传感 (TRPS)；以及单一 EV 分析法 (SEA)

外泌体显微成像. a) SEM；b) TEM; c) cryo-EM; d) AFM from Shao, H., et al. 2018. Chem Rev.

外泌体相关蛋白鉴定：外泌体蛋白的鉴定和定量不仅有利于鉴定外泌体的来源及其内容物、而且对于外泌体生理病理标志物的鉴定也非常重要。传统的方法包括 WB、ELISA、质谱；这些年针对外泌体的研究也出现了一些新方法，包括小颗粒流式细胞仪、微核磁共振、Nanoplasmonic Exosome (nPLEX) Sensor、Integrated Magnetic-Electrochemical Exosome(iMEX) Sensor、和 ExoScreen。

WB 和 ELISA 鉴定外泌体蛋白. a) WB； b)  ELISA from Shao, H., et al. 2018. Chem Rev.

外泌体携带大量的 RNA 和 DNA，RNA 是主要形式，通常为非编码 RNA，包括 miRNA, tRNA, lnRNA, 碎片化的 mRNA 等。越来越多的研究表明，这些 RNA 被外泌体递送到受体细胞并发挥功能活性，因此，外泌体 RNA 在细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物领域都得到了极大关注，此外，外泌体作为 RNA 药物递送体系也具有重要的临床应用价值，得到越来越多的研究。

外泌体核酸抽提流程 from Shao, H., et al. 2018. Chem Rev.

4、 外泌体研究文献解读

这篇文章来自浙江大学张龙教授团队 2018 年 3 月发表于 Nature Immunology，揭示肿瘤外泌体在宿主固有免疫失衡中的重要作用，并阐明了关键分子机制。

研究人员首先发现肿瘤细胞来源外泌体（tumor-derived exosomes, TEXs）抑制宿主固有免疫反应。

然后通过药物筛选和质谱鉴定技术，发现 TEXs 抑制宿主固有免疫的重要组分为 EGFR

通过激酶组的筛查发现巨噬细胞 MEKK2 是 TEXs 递送 EGFR 的靶点，且依赖其 K385 激酶活性。

基因敲除小鼠模型显示 MEKK2 为 TEXs 抑制固有免疫所必需

研究人员通过报告基因分析和免疫共沉淀等技术进行深入的机制研究，发现 MEKK2 与 IRF3 相互作用，通过磷酸化 IRF3 Ser173，并促进 IRF3 的多泛素化修饰，从而抑制其转录活性。

在这篇文章中，研究人员建立了体外和体内实验模型，发现恶性肿瘤细胞往往能够通过分泌大量外泌体抑制宿主固有免疫。进一步通过体外外泌体的大量获取和质谱研究，研究人员证实恶性肿瘤细胞来源外泌体含有并能传递 EGFR 到宿主巨噬细胞并抑制一型干扰素的产生。 TEX 来源的 EGFR 能引起 MEKK2 活化、促进 IRF3 Ser173 发生磷酸化以及 Lys77 发生 K33-链泛素化，从而破坏 IRF3 的核定位，进而抑制其转录活性和一型干扰素的产生。该研究结果不仅发现了肿瘤细胞如何破坏宿主天然免疫，在一定程度上揭示了肿瘤病人免疫力下降的部分原因，也为外泌体的功能解析提供了新的方法和新的探索方向。