土壤的分子生物学特性

在我们的实验室里，最难搞的样品类型之一就是土壤。在开发提取土壤中微生物DNA、RNA的试剂盒和构思提取方法的过程中，我们需要收集记录大量各种类型土壤的有机物含量、质地、pH以及采集地。这些因素与土壤微生物含量息息相关，同样地也影响着提取DNA、RNA的得率。

下文，我将介绍一些影响土壤DNA、RNA提取的关键问题。

腐植酸(Humic substances）：

困扰提取土壤DNA和RNA的最大问题是其中的腐植质含量（腐植酸、黄腐酸等腐殖质）。腐植酸由有机物降解形成（植物、微生物等残骸），并使得土壤呈黑颜色（苯醌基的分子结构）（1）。腐植酸分子都含有羧基和酚基，分子量大小不一。分子间抱团螯合成大分子多价阳离子，使得其非常利于微生物和植物的再次吸收利用（2）。有关腐植质更多详细介绍，请点击这里

因为腐植酸、黄腐酸与DNA、RNA一样都是大分子亲水性阴离子聚合物，很容易在最后步骤跟核酸一起被抽提出来。所以最好在最终洗脱核酸前把他们去除掉。

IRT技术（Inhibitor Removal Technology）：

抑制因子去除技术是MO BIO从土壤样品中去除多苯多酚腐殖质的一项ZL技术。该技术的工作原理是通过改变pH值先溶解后沉淀蛋白等大分子物质。核酸在这个过程中不会被沉淀，从而分离去除掉抑制因子。该技术同样适用于血液中的亚铁血红素和粪便样品、皮肤中的黑色素、法医样品中染血衣服上的染料。

微生物细胞裂解（Lysis of microorganisms）:

去除抑制因子是困难的第一步，而裂解土壤中的微生物细胞则是第二步。否则没法准确描述土壤微生物结构情况。机械裂解法可以快速有效地裂解土壤中的细菌和真菌。我们实验室更喜欢用Vortex Genie 2 ，因为它有比强力高速珠磨研磨机所没有的优势。

宏基因组学（Doing metagenomics）?

使用涡旋仪(Vortex)最大的一个好处就是，它长达10分钟相对轻柔的作用力破碎细胞可以得到更大分子量的DNA。低速转动过程中产生很少的热量，避免过多热量积聚引起的DNA、RNA降解。配合使用MO BIO的裂解缓冲液，可以更大限度减少DNA、RNA的破损，保障核酸分子完整性。 裂解缓冲液也是IRT技术的一部分。宏基因组学要求大分子量DNA，故涡旋仪(Vortex)是最好的选择。

节省经费？

涡旋仪体积小价格便宜，特别适合经费有限的实验室，也特别适合在野外搭建临时实验室。涡旋仪重量轻，最多还能一次处理24个样品。MO BIO 已经开发出一系列用在 Vortex Genie 2.上的适配器（Vortex adapters），适应各种大小的Tube管。

更强的裂解?

涡旋仪和我们的其它溶液足可以裂解绝大部分生物体，而对于一些真菌孢子类则需要更强力的裂解。对于这类样品，我们建议在涡旋振荡前加入加热步骤。就是加样后在65℃~70℃孵育10-15min（4,5）。另一个可选方法是涡旋振荡前反复多次冻融。这些加强的裂解足可以对付坚硬的孢子、真菌细胞。

高速珠磨研磨机如何？

高速珠磨研磨机有时是对付坚硬生物体的有效手段，但过高的速度会过分剪切DNA，产生的热量也会加速RNA的降解。在我们的实验室里，通过凝胶电泳并没有观察到使用高速珠磨研磨机对DNA得率有所贡献。反而Nanodrop 的分光光度计在260nm读数偏高，意味着DNA破损严重。（核酸蛋白定量仪）。使用平板培养计数存活的细菌，发现使用涡旋仪和Precellys出来的结果差不多。不过高速珠磨研磨机Precellys增加了植物和昆虫DNA的释放，稀释了微生物DNA所占的比例。实验过程中应该尽量避免。

总结：

在后面的文章里，将详细介绍土壤DNA的提取方法，以及在使用Powersoil DNA Kit和RNA Powersoil Kit时提高得率和纯度建议和技巧。

参考文献：

• A. Piccolo (2002). "The Supramolecular structure of humic substances. A novel understanding of humus chemistry and implications in soil science". Advances in Agronomy 75: 57–134.

• F.J. Stevenson (1994). Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. John Wiley & Sons, New York

• Techniques in Microbial Ecology, Burlage, Robert S., Ronald Atlas, David Stahl, Gill Geesey, and Gary Sayler, editors. 1998. Oxford University Press, New York, Page 277

• Development of Quantitative Real-Time PCR Assays for Detection and Quantification of Surrogate Biological Warfare Agents in Building Debris and LeachatePascal E. Saikaly, Morton A. Barlaz, and Francis L. de los Reyes IIIApplied and Environmental Microbiology, October 2007, p. 6557-6565, Vol. 73, No. 20

• Evaluation of five commercial nucleic acid extraction kits for their ability to inactivate Bacillus anthracis spores and comparison of DNA yields from spores and spiked environmental samplesLeslie A. Dauphin, Benjamin D. MoserJournal of Microbiological Methods, Volume 76, Issue 1, January 2009, Pages 30-37