土壤微生物总DNA的提取方法比较

实验概要

通过对比不同DNA提取及纯化方法，选择和优化适合于土壤样品不同分子量DNA提取及纯化的技术路线。

实验原理

土壤是微生物最大的栖息地，20世纪80年代，微生物学家采用免培养(culture-in-dependent)方法，即直接从土壤中提取微生物总DNA的技术，使得在基因水平研究这些未培养微生物的存在、群落结构和功能等情况成为可能。从环境样品中直接提取和纯化微生物总DNA是在分子水平上研究未培养微生物基因资源的关键。从环境样品中提取核酸通常有两种方法：直接裂解法(也称为原位裂解法)和间接裂解法(也称为异位裂解法)。直接裂解法是先在原位将细胞裂解后直接从土壤样品中提取DNA。间接裂解法是先把细菌细胞和土壤颗粒分开，然后裂解细胞，提取DNA，最后进行纯化。就DNA产量、分子操作所需要的DNA纯度和微生物多样性的代表性而言，两种方法各有优缺点。

主要试剂

DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃PO₄, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)

蛋白酶K(25 mg/mL)

溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)

20% SDS

氯仿:异戊醇(24:1)

异丙醇

70%乙醇

RNAse 20 mg/mL

TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

Nycodenz(Axis-Shield, Oslo, Norway；8 g Nycodenz溶于10 mL灭菌蒸馏水)

主要设备

50mL和1.5 mL离心管

水浴锅

高速离心机

涡旋器

实验材料

土壤样品

实验步骤

1. 直接法

    (1) 称取1 g土壤样品，置于50 mL灭菌的离心管中；

    (2) 加入13.5 mL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃PO₄, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)，混匀后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)，37℃水浴30 min，每隔10 min颠倒混匀；

    (3) 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；

   (4) 8 000 r/min室温离心15 min，取上清，用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次；

   (5) 水相中加入0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀过夜；

    (6) 11 000 r/min 4℃离心20 min收集DNA沉淀；

    (7) 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 μL ddH₂O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，转入1.5 mL离心管。

2.  PVP预处理直接法

    (1) 取1 g土样，置于50mL灭菌的离心管中；

    (2) 加入10 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；

    (3) 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；

    (4) 用5 mL PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂HPO₄, 2 mmol/L KH₂PO₄, pH 7.4)漂洗一次；

    (5) 沉淀按照1直接法提取DNA。

3. Nycodenz密度梯度离心间接法

   (1) 称取1 g土样，置于50 mL灭菌的离心管中；

    (2) 加入15 mL预冷蒸馏水，涡旋混匀；

    (3) 用移液枪将10 mL Nycodenz(Axis-Shield, Oslo, Norway；8 g Nycodenz溶于10 mL灭菌蒸馏水)轻轻泵入土壤悬液底部，11 000 r/min，4℃离心30 min；

    (4) 小心收集在Nycodenz-土壤混合颗粒和上层水层分界面的液体，加入10 mL灭菌蒸馏水重悬，10 000 r/min 4℃离心20 min去除含有Nycodenz溶液的上清液；

    (5) 沉淀按照2.2.2.1直接法提取DNA。

4. 结合差速离心的Nycodenz密度梯度离心间接法

    (1) 称取100 g土样，加入150 mL预冷蒸馏水，搅拌混匀，双层纱布过滤后700 r/min，4℃离心5 min，收集上清；

    (2) 沉淀再经过两次重悬和离心，合并所有的上清；

    (3) 10 000 r/min，4℃离心10 min后弃上清，沉淀用15 mL 0.8% NaCl重悬；

    (4) 将10 mL Nycodenz(8 g Nycodenz溶于10 mL灭菌蒸馏水)加入土壤悬液底部, 11 000 r/min，4℃离心30 min；

    (5) 小心收集在Nycodenz－土壤混合颗粒和上层水层分界面上的白色细胞层，加入10 mL灭菌蒸馏水重悬，10 000 r/min 4℃离心20 min去除含有Nycodenz溶液的上清液；

    (6) 沉淀按照直接法提取DNA。