在滤膜上进行细菌DNA的杂交实验

带有固定转化克隆 DNA 的滤膜 寡核苷酸探针

甲醛 预杂交 杂交液 BLOTTO 预洗液 洗脱液

LB、TY 或 Terrific 肉汤

一、材料

1. 缓冲液和溶剂

甲醛，预杂交/杂交液，1X BLOTTO，预洗液（6X SSC 或 6X SSPE），洗脱液 1（2X SSC，0.1% (m/V) SDS），洗脱液 2（1X SSC，0.1% (m/V) SDS），洗脱液 3（0.1X SSC，0.1% (m/V) SDS）。

2. 培养基

含有适当抗菌素的 LB、TY 或 Terrific 肉汤。

3. 核酸和寡核苷酸

带有固定转化克隆 DNA 的滤膜。

4. 探针

³²P 标记的双链 DNA 探针或合成的寡核苷酸探针。

5. 专用设备

(1) 水浴锅

(2) 玻璃烤盘（15 cm X 7.5 cm X 5 cm ) 或其他杂交容器

(3) 温度可调至 42℃（如在甲醛中进行预杂交）、50℃ 和 68℃ 的培养箱

(4) 放射性墨水

(5) 水溶胶条

(6) Whatman 3 MM 滤纸或相当产品

(7) 木制牙签或接种环

二、方法

滤膜的预洗脱和预杂交

1. 将已经过烤干或交联处理的滤膜漂浮于托盘中 2X SSC 液体表面，直至滤膜从底部完全浸湿，再浸泡 5 min。

由于某些批号的硝酸纤维膜可在杂交和干膜过程中发生膨胀和交形，这会使以自显彩片上的方向性标记与滤膜或琼脂板进行校对很困难。使用前将干的滤膜加在湿的 3 MM 滤纸之间进行高温高压 [10 psi（0.70 kg/cm²) 10 min ]，可以部分缓解这一问题。尼龙膜不存在此问题。

2. 将滤膜转移至盛有至少 200 ml 预洗脱液的玻璃烤盘内，将液体中的滤膜叠成一摞，用保鲜膜封好烤盘，置于培养箱内的旋转平台上，于 50℃ 保温 30 min。

预洗脱可去除细菌克隆残体，尤其是对密度很高的克隆进行筛选时，可明显降低杂交背景。

在这里以及以后的所有步骤中，滤膜都应缓慢摇动以防止相互粘在一起。在预洗、预杂交或杂交等所有过程中，都不要使滤膜干燥。

3. 用经预洗脱液浸泡过的 Kimwipes 刮去滤膜表面的细菌残体，将细菌残体刮除不会影响阳性杂交信号的密度和清晰度。

4. 将滤膜转移至盛有 150 ml 预杂交液的玻璃烤盘内，于适当温度下（如杂交在水溶液中完成用 68℃；在 50% 甲醛中完成用 42℃）缓慢晃动 1~2 h 或更长。

滤膜应被预杂交液完全覆盖。预杂交过程中，硝酸纤维膜上被单链或双链 DNA 非特异结合的部位应由 BLOTTO 液中的蛋白质所封闭。摇动可使滤膜连续地被预杂交液所沐浴和覆盖。

探针的变性与杂交滤膜

5. 于 100℃ 加热 5 min 使 ³²P 标记的双链 DNA 探针变性，然后立即置于冰浴中。

也可用加入 0.1 体积的 3 mol/L NaOH 进行探针的变性。于室温 5 min 后，将探针转至冰浴中并加入 0.05 体积的 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.2) 和 0.1 体积的 3 mol/L HCl。置探针于冰浴中直至使用。

单链探针无需变性。



6. 将探针加入到覆盖滤膜的预杂交液中，于适当温度温育直至 C₀t_1/2 达到 1~3。杂交过程中，应将容器密封以防止液体因蒸发而丢失。

7. 杂交完成后，倾去杂交液，并迅速将滤膜浸泡于大体积（300~500 ml ) 的洗液 1 中，缓慢晃动滤膜并至少翻转一次。5 min 后，将滤膜转至盛有新洗液的容器内，继续缓慢晃动。重复洗膜两次以上。

8. 于 68℃ 在 0.5~1.5 h 内用 300~500 ml 洗液 2 洗膜两次。

9. 将滤膜置于 3 MM 滤纸上，室温干燥。在滤膜下面贴上水溶胶条，再将滤膜置于一张干净、干燥而平展的 3 MM 滤纸上，紧压滤膜使之与滤纸粘牢。

10. 用放射性墨水或化学发光试剂在 3 MM 滤纸几个不对称位置上作标记。用保鲜膜覆盖滤膜和已作标记的滤纸，用胶条从滤纸的背面粘牢保鲜膜，平展覆盖滤膜的保鲜膜去除皱褶。

这些标记可用来对自显影片与滤膜进行校对。

杂交信号的分析和阳性克隆鉴定

11. 用酸光成像的滤膜或用 X 射线片（Kodak XAR-2，XAR-5，或其他相当产品）在 -70℃ 曝光 12~16 h 和增感屏分析滤膜。

12. 用放射性墨水留下的标记对 X 射线片与滤膜进行校对，用非放射性纤维头铅笔以非黑颜色在编号的滤膜上作出与 X 射线片不对称点位置一致的标记。

13. 在 X 射线片上贴一张透明纸，在透明纸上标记出阳性杂交信号的位置，也标记出 ( 用不同颜色）不对称点的位置。从 X 射线片上揭下透明纸，通过透明纸上的标记与琼脂板标记的对应关系，鉴定出阳性克隆。

14. 用无菌牙签或接种环将阳性克隆转移至 1~2 ml 含有适当抗菌素营养丰富的培养基 ( LB、YT 或 Terric 肉汤）中。

15. 经过一段时间培养，用微量制备方法之一可从培养物中提取质粒 DNA，并可用限制酶酶切或 PCR 方法进一步分析质粒 DNA。