| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 完整的人角膜 |
| 试剂、试剂盒 | CMF-SaIineG 中性蛋白酶II L型胶原酶 1mg ml在DMEM F-12 GASP中 CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶 DMEM F-12 GASP DMEM F-12 2FB GASP:DMEM F-12 GASP含2%FBS CMF GASP |
| 仪器、耗材 | 87.5px塑料组织培养皿或6孔板 手术刀或单刃的安全刀片 细胞滤网 70μm血液尼龙过滤网 塑料刮片 “CellLifter”或“CellScraper” 弯虹膜剪 275px(4-3 8in.) Jeweler’s镊 250px(4in.) 角膜剪 19mm刀刃 尖头 Colibri缝线钳 0.1mm |
| 实验步骤 | (a)用CMF-SalineG清洗角膜3×5 min。 (b)剪除残留的巩膜，结膜和虹膜。 (c)加人2ml 1.2U中性蛋白酶II，4℃摇床摇动过夜。 (d)将加入中性蛋白酶II的角膜4℃摇30 min。 (e)用DMEM/F-12/GASP洗涤角膜。 (f)解剖显微镜下，小心去除上皮和内皮细胞。 (g)用塑料刮片轻刮基膜的上皮细胞面和内皮细胞面。显微镜下观察，以确保完全去除这些细胞层。 (h)用新鲜培养基清洗角膜基质一次。 (i)用手术刀或安全刀片或精细手术剪将基质剪碎成2 mm左右的小块。 (j)用DMEM/F-12/GASP配制的胶原酶37℃消化3 h,直到大多数组织消失。 (k)400g离心10 min,弃上清。 (l)用DMEM/F-12/GASP重悬细胞，用70μm细胞滤网过滤消化液，并离心。 (m)重复上述清洗步骤两遍，每遍之后细胞计数。 (n)用MJM将分离出的间质细胞重悬并以1×104cm2的密度接种于塑料组织培养皿中。 (o)每3天更换一次培养基。 (P)当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代：吸出培养基，用CMF-SalineG洗一次。加人胰蛋白酶或TrypLE至仅仅覆盖细胞，37℃，10 min。加人DMEM/F-12/2FB终止消化。细胞计数。将重悬的细胞离心，弃上清。用足量新鲜配制的MJM培养基将细胞重悬，以1×104cm2的密度接种 |
| 注意事项 |
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