实验概要
掌握培养细胞中RNA的检测方法。
实验步骤
1．制胶(1％)：
琼脂糖 2.5g
10×Mops缓冲液 25.0ml
H2O 192.0ml
2．在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。
3．取出胶冷却到60℃，于通风柜中加45ml甲醛，混匀。
4．加20μl溴化乙锭，混匀。
5．令胶液再冷却10分钟。
6．将其倒入四面封好的电泳槽中，加样品梳，约20分钟形成电泳凝胶。
7．加入1×Mops缓冲液于电泳槽，盖满胶表面，但不>1cm。
8．取10～15μg RNA样品，真空离心干燥，再溶于20μl载样缓冲液，加热95℃ 2分钟，使RNA变性。
9．每孔中20μl RNA点样，同时加一标准物。
10．一般35V电泳，从下午4：00pm～9：30am。
11．取出胶在紫外灯下观察，将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上28S(约5kb)18s(约2kb)处可见明显的溴化乙锭带。
12．用500ml 10SSC浸泡洗涤胶2次，每次20分钟，去除甲醛。
13．其它吸印步骤完全与Southern Blot相同，只是吸印缓冲液为10×SSC。
14．室温下至少吸印12小时。
15．吸印完成后，取出胶与滤膜，表明加样起始部位、膜的方向及标号、用Whatman滤纸包好，80℃真空干燥2小时；如为尼龙膜在紫外灯下照射5分钟。
16．分子杂交：杂交原理与Southern Blot相同，但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备：
50％甲酰胺
1％ SDS
1M NaCl
10％硫酸葡聚糖
17．将滤膜放入塑料袋，加入10ml预杂交液，去除气泡后封袋，在42℃水浴中振荡至少6小时。
18．制备变性鱼精DNA≥100μg/ml，变性同位素标记的探针(加入袋中的终浓度≤10ng/ml或1～4×105dpm/ml)。
19．将此液0.5～1ml以针头注入含预杂交液的塑料袋中，排除气泡，从针眼处重新封死塑料袋，再用玻棒在袋上赶几次，使探针与预杂交液充分混匀，42℃振荡水浴6～42小时。
20．膜的洗涤：
1) 2×SSC 100ml室温中振荡5分钟，共2次。
2) 1％SDS，2×SSC 200ml， 60℃振荡30分钟，共2次。
3) 0.1×SSC 100ml室温振荡30分钟，共2次。
21. 膜在室温中自然干燥后，用塑料纸包好即可进行放射自显影过程(同DNA检测)。