培养细胞标记和裂解物的制备实验

培养细胞

DMEM HCl TBS Tris

微量离心管 Plexiglas盒 吸头 细胞刮子 冷冻离心机

1.  培养待标记的细胞至适当的生长期。

对于贴壁细胞：

2a.  吸去培养液，用37℃的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐培养液，吸尽该培养液。

3a.  加入预热的标记培养液，加入量为：0.5~1 ml/35 mm 培养皿，1~2 ml/50 mm 培养皿，或2~4ml/ 100 mm 培养皿。

对于非贴壁细胞：

2b.  1 800 g 离心1 min，吸去培养上清，细胞用含血清不加标记物的标记培养液重悬， 再次离心吸去堉养液。

3b.  每10⁷细胞加入2 ml 标记培养基至适合大小的培养平皿。

4.  在Plexiglas 挡板后操作，使用配备塞有棉花分防气溶胶的傲量移液器加入³²Pi至终浓度为0.1~2 mCi/ml。

5.  将培养皿置于预热的Plexiglas 盒中，并将金子置于培养箱中。

6.  标记结束时，将装有标记细胞的Plexiglas 盒移至冷室，放在Plexiglas 挡板后面。

对于贴壁细胞：

7a.  从Plexiglas 盒子中取出培养皿，用一次性的移液管吸尽标记培养液，培养液和吸头或吸管均作为同位素废物弃置。

8a.  用2~10 ml 冷TBS洗涤细胞2次，同步骤7吸尽并弃去放射性废物。

9a.  加适量裂解缓冲液，用橡皮细胞刮子擦刮下贴壁细胞，裂解物留在培养皿上，4℃放置20 min。用橡皮细胞刮子将贴壁细胞的裂解液移至培养皿边缘，并将裂解液移入带螺口盖的微量离心管中。

对于非贴壁细胞：

7b.  从Plexiglas 盒子中取出培养皿，将细胞移至带螺口盖的微量离心管中，1 800 g 离心1 min，回收细抱，吸尽培养液。

8b.  细胞用小体积的冷TBS重悬，移至带螺口盖微量离心管中，1 800 g 离心1 min，吸尽TBS。

9b.  毎10⁷细胞用0.5~1 ml 适当的裂解缓冲液悬浮细胞，用一次性的巴斯德吸管轻轻混匀，4℃放置20 min。

10.  盖上管盖，于4℃ 26 000 g 离心30 min 澄清裂解液。 
 

11.  离心后，将上清（裂解物）移至新的离心管中，离心管和沉淀作为同位素污物处理。

12.  用凝胶电泳，免疫沉淀或蛋白质纯化方法，分析标记的裂解液，所有过程均在4℃适当屏蔽下进行。