基因克隆：高效感受态细胞制作

因RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高，本实验操作以此为例说明。

细胞样品

MnCl2HEPESCaCl2 SOB 培养基SOC液体培养基液氮

水浴锅三角瓶玻璃瓶冷冻离心机滤膜离心管称量天平

一、LB培养基配制（固体培养基加2%琼脂粉）

酵母粉Yeast Extract      5g

蛋白胨Peptone/g    10g

NaCl                     10g

水                   1000ml

二、TFBI溶液配制

RbCl(氯化铷)                               5 g

1 M KAc(醋酸钾)                   12.3 ml

1 M CaCl₂(氯化钙)                  4.1 ml

1 M MnCl₂(氯化锰，粉色)     20.5 ml

glycerol(甘油)                         61.5g

0.1 M HAc(醋酸)                      8 ml   调节pH至5.8

超纯水                         补足至410ml

注：配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。

三、TFBII溶液配制

1 M MOPS （pH 6.5，溶液为黄色)       1.5 ml

1 M CaCl₂(氯化钙)                            11.25 ml

1 M RbCl                                              1.5 ml

glycerol(甘油)                                       22.5 g

1 M KOH(氢氧化钾)                     调节pH至6.5

超纯水                                       补足至150ml

注：配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。

四、高效感受态细胞制备

1. 取实验室-80度保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线，37度培养过夜，进行活化。；

2. 从LB平板上挑取单菌落，尽量选择菌落较饱满，边缘平滑，个头较大、长势较好的菌落；

3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中；

4. 37℃下振荡培养过夜（摇床转速200rpm，12h左右），进行充分活化；

5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h至OD590达0.4~0.6；

6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50mL离心管中，冰上放置10min（此时，可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷了，离心机也要开始预冷了，如果你们的离心机降温较慢，最好再提前一点）；

7. 在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清；

8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液（如果前面使用的是60ml，这里则为60/2.5=24ml），轻轻悬浮细胞，冰上放置10min；

9. 4℃，4000rpm离心10min，弃去上清；

10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII（如果前面使用的是60ml，这里则为60/25=2.4ml，也即为TBFI的1/10，当然具体体积也可以根据个人经验上下变动），轻轻悬浮菌沉；

11. 分装至EP管中，每管分装100ul（EP管最好预冷，分装过程要求在冰上进行）；

12. -80度长期保存（至少可以保存一年）.

1. 挑选低代数的菌种是关键，千万不要每次活化后保存活化后的菌种，更不要将菌种长期保存在-20度。

2. 大肠杆菌在平板上过夜生长后，可置冰箱中保存一个月左右；接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长，从而使细菌群体在达到一定的OD值后（0.375）大部分细胞都处于感受态。

3. 大肠杆菌的生长需要氧气，剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长。

4. 达到细菌对数生长早、中期，需时约2.0——2.5小时，此步骤至为关键，若超过此阶段，则转化效率急剧下降。

5. 低温操作的目的是使细胞不再生长，保持其感受态。

6. 洗涤细胞时细胞较脆弱，悬浮沉淀时动作要轻，可用移液枪轻轻吸打。

7. -80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。

为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个因素：

1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过检测培养液的OD600来控制。

2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

3. 试剂的质量：所用的试剂需是最高纯度的（GR或AR），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液器吸头等最好是新的，并经过高压灭菌处理，所有的试剂都要过滤除菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。