基因合成实验

DNA

dNTPDAN聚合酶乙醇TE限制性内切核酸酶缓冲液

水浴锅培养箱

1. 将两种寡核苷酸各1 μg加入微量离心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min，然后在合适的退火温度下保温5 min，取2 μl 留待以后的分析。

2. 加2μl 4种dNTP混合液和10U测序酶，30℃温育30min。

3. 70℃ 10min 灭活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。

4. 加10×限制性内切酶反应缓冲液，加水和20——100 U 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h以上。

5.  酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl的无水乙醇，-70℃沉淀15 min，离心5 min，沉淀重悬于100 μl TE缓冲液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗涤沉淀，干燥，20 μl TE缓冲液溶解，取2 μl用于以后的分析。

6. 用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物，估计延伸的寡核苷酸的量，再用适当的载体亚克隆。

7. 对几个合适的亚克隆测序。

1. 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

2. 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀都要用振荡器进行，避免产生气泡。