基因工程菌－海洋线虫系统的生物测定

实验概要

本实验在成功构建了表达Cip蛋白的重组酿酒酵母的基础上，对其应用于Panagrellus redivivus线虫的生物测定进行了探讨，并与重组大肠杆菌比对。

主要试剂

1. 主要试剂

   1) 蛋白胨（Peptone)，广州环凯微生物科技有限公司；

   2) 尿嘧啶（Uracil)，AMRESCO进口分装，上海生工；

   3) 胆固醇（Cholesterol)，AMRESCO进口分装，上海生工；

其他试剂为国产分析纯。

2. 培养基和常用溶液

   1) NGM（Nematode Growth Medium)培养基

NaCl                          3 g

Peptone                        2.5 g

H₂O                           to 1 L

如配制固体培养基，还需加入1.7％琼脂粉。高压灭菌50 min后，待培养基冷却至55℃，依次加入下列试剂：

CaCl₂（1 mol/L)                1 mL

Uracil（2 mg/mL)               1 mL

Cholesterol（10 mg/mL)          0.5 mL

磷酸钾缓冲液（1 mol/L，pH 6.0) 25 mL

MgSO₄（1 mol/L)               1 mL

小心混匀后，倒平板，注意不要引入气泡，NGM平板可在4℃保存数周。配制液体NGM则待完全冷却后，依次加入上述试剂。

   2) M9缓冲液

Na₂HPO₄                       6 g

KH₂PO₄                        3 g

NaCl                           5 g

MgSO₄·7H₂O                   0.25 g

以双蒸水定容至1000 mL，高压灭菌50 min，室温保存。

   3) 0.1％硫柳汞，称取0.1 g硫柳汞溶于100 mL双蒸水中，细菌过滤器过滤除菌，4℃保存。

   4) 1 mol/L CaCl₂溶液，称取无水CaCl₂ 11.1 g，溶于100 mL双蒸水中，高压灭菌20 min，保存于4℃。

   5) 2 mg/mL尿嘧啶（Uracil)，准确称取尿嘧啶100 mg溶于50 mL双蒸水中，细菌过滤器过滤除菌，4℃保存。

   6) 10 mg/mL胆固醇（Cholesterol)，确称取胆固醇0.5 g溶于50 mL无水乙醇中，4℃保存。

   7) 1 mol/L磷酸钾缓冲液（1 mol/L K₂HPO₄，1 mol/L KH₂PO₄，pH 6.0)，分别配制2 mol/L K₂HPO₄及2 mol/L KH₂PO₄溶液，准确量取12.3 mL K₂HPO₄溶液与87.7 mL KH₂PO₄溶液，与80 mL双蒸水充分混匀，测定溶液的pH值，如有必要微调至6.0，以水定容至200 mL，高压灭菌20 min，4℃保存。

   8) 1 mol/L MgSO₄溶液，称取MgSO₄·7H₂O 24.647 g，溶于80 mL双蒸水，定容至100 mL，高压灭菌20 min，保存于4℃。

主要设备

1. 24孔及96孔细胞培养板，美国Corning公司；

2. XSZ-D2型倒置显微镜，重庆光学仪器厂；

3. Leitz020-435.025光学显微镜，德国ERNST LEITZ WETZLAR GMBH；

4. 40倍双目解剖镜，日本Nikon；

5. 细菌过滤器（0.2 µm孔径)，美国Pall公司。

实验材料

1. 大肠杆菌Escherichia coli OP50；

2. 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1；

3. 重组酿酒酵母INVSc1/pYES2.1/V5-His-TOPO-cipA、INVSc1/pYES2.1/V5-His-TOPO-cipB；

4. 海洋线虫Panagrellus redivivus。

实验步骤

1. 菌株的培养

   1)  大肠杆菌的培养

在LB（50 µg/mL Car)培养基中培养基因工程菌BL21（DE3)/pET-15b-cipA、BL21（DE3)/pET-15b-cipB、BL21（DE3)/pET-15b至对数生长期，将菌液均分为两份，一份中加入IPTG溶液（终浓度为1 mmol/L)，另一份不加，37℃继续培养8~12 h。

   2)  酿酒酵母的培养

对携带有cipA或cipB基因的重组酿酒酵母，挑取直径2 mm左右的单菌落，挑取SC-U（2％葡萄糖)平板上重组酵母单菌落，接种于15 mL SC-U（2％葡萄糖)中，250 r/min、30℃培养过夜；测定菌液OD₆₀₀值，分别吸取2 mL菌液，离心（1500 g，4℃，5 min)，将细胞沉淀以无菌SC-U（2％半乳糖)培养基洗涤一次，分别重悬于10 mL无菌SC-U（2％半乳糖)和10 mL无菌SC-U（2％葡萄糖)中，250 r/min、30℃分别培养18 h、12 h；

对酿酒酵母INVSc1，于YPD液体培养基中培养12 h即可。

2. 线虫的制备

   1) 线虫的培养

      A. 按照2％的接种量，接种E. coli OP50 100 µL于5 mL LB培养基中，37℃，200 r/min振荡培养24 h；

      B. 吸取培养OP50菌液0.1 mL，滴加至NGM平板上，无菌刮棒平铺后，37℃倒置培养24 h；

      C.  将线虫种接入培养有OP50菌株的NGM平板上，置于25℃。

   2) 无菌J1线虫的获得

      A. 查看NGM平板上雌虫的形成情况和怀卵情况，一般培养42 h后大部分雌虫都有发育成熟的卵；

      B. 超净工作台上，收集怀卵雌虫，用无菌针头将怀卵雌虫挑至装有无菌M9缓冲液的培养皿中；

      C. 以无菌M9缓冲液清洗收集的线虫三次：吸取M9缓冲液到培养皿中，混合均匀，使线虫悬浮并与液体充分接触，待线虫自然沉降后，用移液器将缓冲液吸走；

      D.  加入0.1％硫柳汞，使怀卵雌虫充分悬浮，置于25℃，50～70 r/min体表消毒半小时；

      E.  挑10条左右上述处理后的怀卵雌虫，置于培养皿中，加入200 µL无菌M9缓冲液；

      F. 解剖镜下，用无菌针头将虫体刺破，待卵自然漂浮离体后，将虫体移开；

      G. 选取漂浮的单颗分离的卵，用无菌200 µL吸头吸至加有无菌M9缓冲液的24孔细胞培养板上，每孔100～150颗卵；

      H. 以无菌M9缓冲液清洗收集的卵2次，清洗后，待卵自然沉降，解剖镜下吸走液体，小心不要吸走卵；

      I. 加入400 µL无菌NGM液体培养基，置于25℃，50～70 r/min缓摇过夜，观察是否有细菌生长，以及卵的恢复情况；

      J. 2～3天后，如果没有杂菌生长，由卵所孵化出的J1幼虫即可视为无菌幼虫，可以用于后续的实验操作。

3. 重组大肠杆菌－海洋线虫培养系统的建立

以无菌Panagrellus redivivus J1幼虫为目标线虫，按照以下方法建立液体测定系统：

   1)  生物测定前，测定各待测菌液的OD₆₀₀值，如有必要，以无菌LB（50 µg/mL Car)液体稀释各菌液至相等的OD₆₀₀值，待用；

   2) 在24孔细胞培养板上，分别加入各待测菌液（包括诱导和未诱导的)，每孔250 µL，以无菌LB(50 µg/mL Car)为空白对照，每个处理设三个重复；

   3) 每孔中加入15条J1线虫，以parafilm膜封口；

   4) 25℃下，将培养板置于水平摇床上缓摇培养（70 r/min)，每24 h检查线虫生长、繁殖及死亡情况。

4. 重组酿酒酵母—海洋线虫培养系统的建立

以无菌Panagrellus redivivus J1幼虫为目标线虫，按照以下方法建立液体测定系统：

   1) 对各培养菌液，离心获得细胞沉淀，以无菌NGM洗涤沉淀一次，然后重悬于无菌NGM液体中。以无菌NGM培养基为空白对照，调整细胞悬浮液的OD₆₀₀值，使之均为2.5；

   2)  在24孔细胞培养板上，分别加入培养的酵母细胞悬液（包括诱导和未诱导的)及对照悬浮液，每孔250 µL，以无菌NGM液体为空白对照，每个处理设三个重复；

   3)  每孔中加入10～15条J1线虫，以parafilm膜封口；

   4) 25℃下，将培养板置于水平摇床上缓摇培养（70 r/min)，每24 h检查线虫生长、繁殖及死亡情况。

5. 镜检与数据分析

倒置显微镜及体视镜下，检查幼虫生长发育情况、雌雄虫形成、雌虫怀卵量、繁殖情况、各种虫态的死亡情况以及第二代线虫的形成情况。

数据以百分数形式表示，经平方根反正弦转化后，以SPSS 11.5 软件进行统计分析。本文中，除明确说明外，生物测定的平均数据以“平均数±标准误（SE)”表示，方差分析采用邓肯氏新复差检验法（Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT)。