基因工程角蛋白酶的研究

以往对角蛋白酶的研究工作主要集中于菌种筛选、酶的提取纯化和活力测定等基础工作，对酶结构和基因表达的研究极少。20世纪90年代，随着分子生物学技术的发展，国外的一些学者开始进行角蛋白酶基因工程表达和分子结构等方面的研究。Lin X等采用随机引物PCR的方法获得了编码地衣芽孢杆菌PWD-1菌株分泌的角蛋白酶基因（Ker A）的全序列，Ker A基因与地衣芽孢杆菌NCIMB6816编码Carlsberg枯草杆菌蛋白酶的基因具有97％的同源序列。

将Ker A基因转染产酶缺陷型枯草杆菌DB104菌株，该转化菌株能在含羽毛的培养基和LB培养基中产生活性角蛋白酶[14～16]。Woodfolk JA等从红色毛癣菌cDNA文库克隆了Tri r4，并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达了重组蛋白Tri r4，一个含726个氨基酸的蛋白质，属丝氨酸蛋白酶家族。

另外，还在埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21中表达和发现了Tri r2，一种毛癣菌的新抗原，编码412个氨基酸，属D类枯草杆菌蛋白酶亚家族；通过SYBYL分子模建软件包进行分子模建，明确了Tri r2的三维分子结构和免疫优势T细胞抗原决定簇的分子位点[9,17，18]。

2002年，Descamps F等[19]成功地从犬小孢子菌中获得了3个具有角蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶的基因全序列，并通过毕赤酵母系统重组表达了SUB3角蛋白酶[6]。Wang JJ 等[20]用枯草杆菌表达系统和埃希氏大肠杆菌系统表达了角蛋白酶—链亲和素融合蛋白，并用生物素—亲和素一步法纯化了融合蛋白，提高了纯化效率和角蛋白酶的稳定性。上述研究为角蛋白酶的工业化生产与应用提供了良好的工作基础。由于微生物在底物诱导状态下表达角蛋白酶，而在非底物诱导状态下不表达角蛋白酶，因此，差异PCR等方法不失为发现角蛋白酶新基因的良好手段。