基因编辑技术是什么

基因编辑技术不断发展，到现在已发展到第三代基因编辑技术。第三代基因技术CRISPR/Cas克服了传统基因操作的周期长、效率低、应用窄等缺点。作为一种最新涌现的基因组编辑工具，CRISPR/Cas能够完成RNA导向的DNA识别以及编辑。通过一段序列特异性向导RNA分子（sequence- specific guide RNA）引导核酸内切酶到靶序列处，从而完成基因组的精确编辑，因其操作简单、成本低、高效率，近几年成为炙手可热的基因编辑手段，目前已广泛用于模式生物研究，医疗，植物作物，农业畜牧等领域。

1 磨快CRISPR利器，加快科学发现

CRISPR/Cas9的出现给了科研人员无限想象的可能，基于CRISPR/Cas9的技术很快就被广泛应用于全世界各个实验室中，这里我们将主要介绍最常用的几种应用。

早期，科研人员通过同源重组（HR）介导的基因打靶技术来实现基因编辑，但因效率太低，极大地限制了其应用。为了克服这一难题，一系列通过核酸内切酶介导的基因编辑技术被开发出来，通过这些核酸内切酶切割特定的基因组序列，借助细胞自身修复体系如非同源末端连接或同源重组修复方式，并由此达到改变基因组序列的目的，锌指核酸内切酶（ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）以及sgRNA介导的Cas9核酸内切酶正是基于此原理工作的。

锌指核酸内切酶（ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）均可通过蛋白-DNA相互作用识别基因组上的特定DNA序列并完成特定位点的切割，但是它们因效率低下、可选潜在位点少、成本高等原因极大地限制了它们的应用，直到CRISPR/Cas9系统的出现，科研人员才找到了一种成本低、效率高、简单易用的基因编辑工具。

CRISPR/Cas9出现之后，科研人员最先想到的便是将其运用到基因编辑上了，根据目标基因的外显子序列设计single guide RNA（sgRNA）并与含有Cas9编码序列的质粒一起转入细胞，sgRNA通过碱基互补配对的原则引导Cas9蛋白靶向目标DNA序列，Cas9蛋白会在该位点切割DNA，引发DNA双链断裂（DSB），此时细胞通过非同源末端连接修复（NHEJ）完成DNA的自身修复，

因修复过程中常常发生碱基的添加和丢失，而最终导致基因的移码突变从而达到基因敲除的目的，或者针对目的基因的上下游序列各设计一个sgRNA，从而引发该基因上下游同时发生DSB，再通过DNA损伤修复机制将断裂的上下游两端的DNA连接在一起，引发DNA片段缺失，从而达到基因敲除的目的。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒，细胞就会以此模板进行同源重组修复，如果引入的修复模板是一个想要插入的基因，便可在特定的位置进行基因敲入了。

2 神奇的dCas9多功能工具包

随着人们对Cas9研究的不断深入，Cas9发挥功能的结构基础也渐渐明确，在Cas9发挥切割DNA的功能时，它的两个结构域发挥着重要作用，分别是RuvC和HNH，其中HNH结构负责sgRNA互补链的切割，切割的位点位于PAM的5'端的第三个碱基外侧，RuvC结构域负责非互补链的切割，切割位点是在PAM上游的3-8碱基之间，当将这二者同时突变失活，便产生了失去DNA切割活性的Cas9蛋白了（dCas9），dCas9虽然失去了对DNA的切割能力，但依旧可以在sgRNA的引导下到达指定的DNA序列处，这是基于sgRNA–dCas9复合体的这一特征，若在dCas9上融合不同功能的结构域，便可在特定的DNA区域完成不同的修饰了，这便形成了基于CRISPR/dCas9的工具包了。

脑洞大开的科学家利用dCas9蛋白，开发出各种用途的工具，可谓是把CRISPR/dCas9利用得淋漓尽致，这里我们举几个简单的例子如研究人员针对目标基因的启动子序列设计sgRNA，使得sgRNA–dCas9复合体靶向结合到目标基因的启动子上，因dCas9蛋白带来的空间位阻可干扰转录因子的结合，从而引发在转录水平上的干扰基因表达的效果，而在此基础上为了达到更佳的干扰效果，一些能够引发基因转录阻遏的结构域也被融合到dCas9蛋白上，如KRAB（Krüppel-associated box）等。

既然可以通过CRISPR/dCas9实现基因表达的干扰，那是不是也可以通过CRISPR/dCas9实现激活基因表达呢？答案是肯定的。科研人员通过向dCas9上融合vp64（四个串联的vp16）、p65AD（p65 activation domain）等促进促进基因转录的结构域，实现基因的内源性激活，在经过各种优化之后，比如由vp64、p65AD和VPR（Epstein-Barr病毒R反式激活因子Rta47）组成的三联结构域（dCas9–VPR）就可以实现很高水平的内源性激活基因表达的效果了。

通过基于CRISPR/dCas9的基因表达干扰和内源性激活工具的建立，使得科研人员在进行诸如基因功能研究的工作时有了更为简单、高效且低成本的研究工具。这很大程度上为科研人员节约了时间和成本。

3 精准编辑表观遗传修饰

表观遗传研究是近些年来非常火热的领域，DNA甲基化、组蛋白乙酰化等都在生物体中发挥着重要的生物学功能，而CRISPR/dCas9在表观遗传的研究中也成为了十分强大的工具。比如CRISPR/dCas9介导的靶向DNA甲基化修饰，我们知道在DNA甲基化过程中DNA甲基转移酶（DNA methytransferases，DNMTs）起着关键的催化作用，而且大部分DNA甲基化都发生在CpG岛，

因此研究人员尝试着将DNMTs的催化结构域融合到dCas9上形成dCas9-Dnmt3a3L，并通过sgRNA的引导靶向目标DNA序列的CpG附近催化其甲基化，以实现DNA甲基化的定点编辑。相似地，研究人员将在DNA去甲基化过程中起关键催化作用的TET1蛋白的催化结构域融合到dCas9上形成dCas9-TET1，同样的通过sgRNA的引导靶向目标DNA序列的CpG附近，可以实现去甲基化修饰。

再如CRISPR/dCas9介导的靶向组蛋白修饰，与靶向DNA甲基化修饰相似，一些和组蛋白修饰相关的酶包括组蛋白去甲基化酶（LSD1/KDM1A）、组蛋白乙酰转移酶以及组蛋白甲基转移酶等也被融合到dCas9蛋白上，以实现靶向组蛋白修饰。

除以上的应用外，CRISPR/dCas9还被用于其他多个领域，比如将EGFP融合到dCas9上，通过sgRNA靶向特定DNA序列实现基因组成像。此外，还有研究人员开发出基于CRISPR/dCas9的enChIP技术，以来探测特定基因组区域上的DNA-蛋白质相互作用，通过sgRNA靶向特定基因组基因座的标记dCas9的抗体免疫沉淀，之后通过蛋白质谱（enChIP-MS），鉴定与之特异性相互作用的蛋白质。这些工具的开发都极大地帮助了科研人员，使得之前无法实现的操作成为可能，推动了生命科学的快速发展。

4 基因及药物靶标基因的确定

以往基于ZFN或TALENs的基因组编辑技术，需要针对DNA靶序列设计蛋白质，而CRISPR技术仅需要根据不同的靶序列合成相应的80nt左右的sgRNA来引导Cas9蛋白对序列进行修饰，这就实现了基因编辑技术的高通量应用。

CRISPR全基因组筛选技术可用于必需基因及药物靶标基因鉴定。多伦多大学Jason Moffa研究组建立了覆盖全基因组gRNA库并在5个细胞系中逐个敲除了1.8万个基因，最后鉴定出在不同细胞系间保守的1580个必需基因构成的“core fitness genes”。

同样，美国达纳-法伯癌症研究所W. Nick Haining研究组通过CRISPR/Cas9系统性地敲除了黑色素瘤细胞的2368个基因，发现ptpn2基因缺失会使这些癌细胞对PD-1阻断更加敏感。华盛顿大学医学院Michael Diamond研究组利用CRISPR/Cas9鉴定在宿主细胞中坚定了黄病毒感染所绝对必需的9个基因，其中spcs1基因缺失时，不仅降低黄病毒感染率，而且对细胞也不产生副作用，这将是一个潜在的黄病毒药物靶标。

5 疾病建模及器官供体产生

CRISPR/Cas9作为新一代基因编辑技术，同样可被应用于建立疾病模型及培育供体器官。基因治疗可实现在患者自身细胞中纠正遗传缺陷，并结合其他生物学技术在体外培育出组织特异性的“类器官”，对于疾病建模、药物筛查及临床治疗等方面研究有极大意义。CRISPR介导的基因组编辑技术可以直接应用于非人类哺乳动物的疾病模型建立，将更有利于疾病致病机理和治愈研究。

此外，CRISPR技术还可应用于大型动物的基因编辑以研究免疫排斥及跨物种的疾病传染，从而解决异种移植器官来源的瓶颈，猪被认为是人体异种器官来源的首选动物，而目前猪器官用于人类的主要障碍为免疫排斥反应，及猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retroviruses, PERVs）带来的医疗风险问题。eGenesis公司杨璐菡博士与哈佛大学George Church教授利用CRISPR进行基因改造一步让62个PERV pol 基因关闭，因而将来自PERV的传染风险降低了三个数量级，成功培育出不含PERVs的猪品系，作为安全有效的异种移植器官来源，这些研究让猪成为病人的器官来源更有前景。