基因诊断与非淋菌性泌尿生殖道炎（二）

　　五、临床表现

　　（一）男性衣原体性尿道炎（chlamydia urethritis，CU）

　　又称为非淋菌性尿道炎（NGU）。是由衣原体感染引起的非急性化脓性尿道粘膜炎性病变。目前已成为STDs中最常见的一种。

　　本病潜伏期比淋病长，约1-3周或数月，主要表现为尿道内不适，刺痛及烧灼感，并伴有不同程度的尿频、尿急、尿痛，尿痛较淋病为轻。尿道口轻度红肿并有浆液或粘液脓性分泌物，稀薄而量少，长时期不排尿或早晨首次排尿前可见尿道口分泌物污染内裤，并可见尿道口有“糊口”现象；分泌物少时，于晨起挤压尿道才流出少量粘液。合并膀胱炎时可有血尿；无症状性非淋菌性尿道炎，约30-40%病人症状不典型或根本无症状。约1/3左右的淋球菌尿道炎病人合并沙眼衣原体感染，淋病治愈后又出现尿道炎症状，易误诊为慢性淋病或PPNG菌株感染。

　　沙眼衣原体感染易并发附睾炎，表现为附睾肿大，变硬及触痛，多为单侧，部分患者的抗沙眼衣原体抗体升高，可直接从附睾抽吸液中分离出沙眼衣原体；累及睾丸可出现睾丸炎，表现为睾丸疼痛、触痛、阴囊水肿及输精管变硬变粗；累及前列腺时可出现后尿道、会阴及肛门部位钝痛或触痛，可有性功能障碍，直肠镜检可触及有压痛的前列腺。如前列腺明显肿大，可压迫后尿道而出现尿流变细、排尿无力及尿流中断等；本病还可以合并Reiter综合征，即关节炎，结膜炎，尿道炎三联症。

　　（二）女性生殖系统衣原体感染症

　　女性感染衣原体不限于尿道，可累及整个泌尿生殖器官，此类感染常因缺乏自觉症状或症状轻微而忽视了治疗，造成传染源而扩散，形成危害。

　　女性衣原体感染比男性感染引起的症侯要多，其主要感染部位为宫颈，由此垂直感染给新生儿，以至发生PID等，其后遗症多导致不孕症。

　　无症状感染（缺乏症状反应）：由于本病缺乏自觉症状，则局部病象便成为诊断的一个重要指标，表现为阴道有脓样分泌物，亦可为粘液或浆液性。分泌物量较多（为中等量），稍有臭味。阴道粘膜为正常颜色，但常伴有宫颈糜烂。

　　衣原体性宫颈炎：当伴发宫颈炎时、宫颈发红，有浆液或脓性分泌物增加、阴道内糜烂扩大，易于出血等症状。镜检下阴道分泌物的所谓“阴道清洁度”多为III度以上。沙眼衣原体主要侵犯宫颈的柱状上皮细胞，而磷状上皮细胞常不被侵犯，故阴道，宫颈局部没有改变。

　　宫颈炎的主要症状是白带增多，不时出血及小腹部疼痛等一般症状，无特异性表现，多因其性伴患有尿道炎而来院就诊。

　　衣原体性输卵管炎，本症多由宫颈炎并发引起。用腹腔镜直接从输卵管抽吸物标本中，约30%以上检测出衣原体，病情经过多数较轻、下腹部可有轻微疼痛，一般体温不高，但血沉稍快。由于这种非典型经过，使病人拖延就医，往往引起子宫附件损害，形成输卵管炎的后遗症，其最主要表现是输卵管性不孕症。

　　盆腔炎（PID）：PID不是固定疾患的用语，凡在盆腔内感染症，如宫内感染，输卵管炎等附件炎症波及盆腔腹膜特定的部位感染均可称之为PID，由CT引起的PID主要是由宫颈炎上行感染所致。其主要表现是急腹症型。

　　部分患者可导致宫外孕、流产、不孕、死胎及新生儿死亡。有些病人除不孕外，可无任何症状。也可通过产道传染，引起婴儿眼结膜炎、鼻炎、中耳炎、肺炎及阴道炎等。

　　六、诊断与鉴别诊断

　　诊断衣原体性疾患，目前在我国尚未普及，因此，往往漏诊，所以应当重视临床表现，争取做到化验室检测指标求得确诊。

　　患者来就医时，男性主诉常常是尿道疼，不适感或从外尿道流出脓样粘液，或因患“淋病”久治不愈，反复出现上述现象；女性病人常常无症状，只是白带多或因其丈夫有“淋病”史，特意来检查确诊。

　　（一）临床症状

　　首先应排除淋菌性尿道炎

衣原体性尿道炎与淋菌性尿道炎鉴别

　　（二）实验室诊断

　　检测出病原体或病原体特异性DNA是诊断本病唯一标准，近年来由于对CT直接分离培养成功，加之基因诊断技术在CT诊断方面的成功应用，使过去认为难以诊断的疾患已提高到最易诊断的一种疾患，但是上述两项技术特殊，对操作人员及实验设备要求严格，在一般医院实行起来尚难完成。一般只用CT抗原法进行诊断。

　　1．衣原体细胞培养：对沙眼衣原体敏感的细胞株为McCoy细胞、Hela-229细胞和BHK细胞，最常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞，孵育后，用单克隆荧光抗体染色，可迅速诊断，但操作人员一定要熟练，需专业培养。培养法的敏感性为80%-90%，阳性即可确立诊断。

　　2．衣原体细胞学检查法：在感染细胞内可有衣原体的包涵体存在。从感染部位采取细胞标本作涂片，姬姆萨染色包涵体是蓝色或暗紫色，碘染色显示褐色。但敏感性差（40%），目前已较少采用。

　　近年来采用荧光素标记的抗衣原体单克隆抗体，来检测细胞涂片中的衣原体，使用较为方便，目前主要用衣原体外膜蛋白（MOMP）的单克隆抗体的商品试剂（Mico Trak，Pathfinder，Monofluor）。结果判断：要衣原体数>10个才能判为阳性。

　　3．PCR检测衣原体DNA：

　　（1）标本的处理：

　　①取材部位为子宫颈管，男性为尿道，将灭菌白金耳深入宫颈管或尿道1cm左右，转动数圈，停留约30s，取出后置标本缓冲液中。

　　②　　 衣原体DNA提取：

　　将宫颈管内或尿道内刮取物置含0.5% NP-40、0.5%Tween 20，1% SDS和2mg/ml 蛋白酶K的TES缓冲液（50mmol/L Tris-HCl，50mmol/l NaCl，100mmol/L EDTA，pH 8.0）置37℃裂解60min，沸水5min，酚、氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，沉淀物溶于20μlTE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。

　　（2）引物设计：

　　引物对选自衣原体16SrRNA基因，为衣原体属特异性，以DNA合成仪固相亚磷酸三酯合成并纯化。引物对的序列分别为5′GTGGATAGTCTCAACCCTAt 3′(16SrRNA基因位点832-851)和5′TATCTGTCCTTGCGGAAAAC3′(位点1041-1022)。目的扩增片段（832-1041）长210bp。

　　（3）PCR扩增：

　　传统的方法反应体积为100μl，含5x反应缓冲液20μl和FD-DNA聚合酶2U、4种dNTP各200μmol/L以及引物对各25pmol/L。上述成分预先一次性分装于0.5ml离心管，-20℃备用。临用加模板DNa 2μl，短暂离心，加100μl矿物油覆盖。现在试剂已商品化，反应体积为25μl，单管已分装好，只要加入模板DNA即可。置DNA扩增仪进行40次循环扩增。每次循环包括90℃变性45s(第一次循环变性2min)，55℃退火30s和72℃延伸40s（最后一次循环72℃，延伸5min）三个步骤。每次扩增均应作阴阳性对照。

　　（4）扩增产物的检测

　　① 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测：取10u l PCR扩增物作1.5%琼脂糖凝胶电泳、0.5μg/ml溴化乙锭染色，以PGEM-3Zf（+）DNA-Hae Ⅲ为分子量标准，置紫外透射仪观察结果。

　　② 生物素寡核苷酸探针的检测

　　a.探针序列及合成：探针序列为5′ACTCAA-AAGAATTGACGGGGGCCCGCACAa 3′(30mer)，衣原体16Sr RNA基因中的位点为909-938，与PCR扩增片段中间序列互补。以DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化。

　　b.标记：按Riely等方法略有修改。以末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）催化Bio-11-dUTP标记到合成的寡核苷酸探针片段3′-OH端。反应体系含：140mmol/L二甲胂酸钠，30mmol/l Tris-HCl（pH 7.6），100μmol/L Bio-11-dUTP，0.1μmol/L 寡核苷酸片段，0.05%BSA，300U/mlTdT。于37℃保温3h后，加10mmol/LEDTA终止。寡核苷酸片段探针标记后，将标记探针（1ng/μl）作2倍系列稀释，取5μl点膜,封闭后显色。结果探针经32倍稀释（最高稀释度5ng）后仍呈现明显的显色反应，证实探针的标记以及显色效应良好。

　　c.DNA斑点杂交：提取的DNA或其PCR扩增产物0.5mol/l NaOH变性20min，取5μl点于硝酸纤维素膜，烘干；以6×SSC(1xSSC为：0.15mol/l NaCl，0.015mol/L柠檬酸三钠，pH 7.0)浸泡2次，80℃干烤2h。置6×SSC，5×Denhardt液，0.2%SDS，50μg/ml变性牛胸腺DNA，10mmol/l EDTA中于55℃杂交3h后，加入终浓度为150μg/ml的探针，于55℃杂交过夜。以2×SSC-0.1%SDS室温漂洗3次，每次15min。

　　d.显色：将杂交漂洗后的滤膜浸泡于0.1mol/l Tris-HCl (pH 7.5)，0.15mo l/L NaCl，0.05%Tween20，0.05%%TritonX-100，2%BSA中，37℃封闭6min；置4μg/ml亲和素的缓冲液A（0.1mol/l Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH 7.5）中，37℃孵育30min，缓冲液A漂洗3次；再置于含1μg/ml生物素化碱性磷酸酶的缓冲液A中，37℃作用30min，缓冲液A漂洗2次，缓冲液B（0.1mol/l Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，50 mmol /L MgCl2，pH 9.5）漂洗2次。最后将膜泡于含0.1mg/ml磷酸萘酚AS-MX和0.6mg/ml坚固蓝RR的缓冲液B中，暗处显色30min。

　　PCR扩增衣原体DNA有十分高的特异性及敏感性，结合生物素标记的衣原体寡核苷酸探针作DNA斑点杂交。可作为衣原体诊断的金标准，其敏感度可以检测相当于1个拷贝的衣原体DNA分子。