外周血和脐带血中分离单个核细胞

基 本 方 案 FicoH-Hypaque梯度离心法分离单个核细胞

材 料

肝 素 抗 凝 血（附 录 3 G ) 或 者 肝 素 化 的 脐 带 血（I Oml脐 带 血 加 入 I m l 含 250U 的P B S 为宜）

P B S

聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque) 溶液

H B S S
FBS (Hyclone)，加 热 灭 活（56°C ， Ih) 或者不加热均可

R P M I -I O 完全培养基

15m l 或 50m l 圆锥底的离心管
Beckman GPR GH-3.7水平转头离心机（或者等效设备）， 18〜20℃

1.检査肝素化的抗凝血，清除细小的血凝块。将新鲜无血凝块的肝素化抗凝血置于15m l 或 者 50m l 离心管中，用无菌移液管加入等量室温的P B S 。对于浓缩白细胞样品，其 与 P B S 以 1 : 4 比例稀释、混匀。

2 . 倾 斜 45°角持离心管，用移液管吸取聚蔗糖-泛影 葡 胺 溶 液（每 IOml血样/P B S 混合液加入3 ml聚蔗糖-泛影葡胺溶液），伸 入 样 品 管 底 部 ，缓缓将聚蔗糖-泛影葡胺溶液加入血样/P B S 混合液底部。 18〜20°C ， 900 g 持 续 离 心 30 min。

3 . 用无菌移液管将含血浆和大部分血小板的最上层 弃 去（图 8. 1.1)，用另一移液管将其下层的单个核细胞移入新的离心管。加入过量的 H B S S( 达 到 细 胞 层 3 倍 体 积 的 量）洗 细 胞 ， 1 8 〜20°C ， 400 g 离 心 lOmin，弃 上 清 。重复洗细胞以除去大部分血小板。

4 . 用 R P M I -I O 完全培养基重悬单个核细胞。 计数细 胞（附 录 3A )，并用台盼蓝标记排除死细胞（附 录 3 0 。

5 . 若样品为脐带血或婴儿血，为了获得纯的单个核细胞，可重复聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心以避免红细胞及其前体的污染。

6 . 如果需要，可用流式细胞仪检测 P B M C 纯 度（单 元 4. 2)。

辅 助 方 案 贴 壁 法 去 除 单 个 核 细胞 中 的 单 核 细 胞和 巨 噬 细 胞

基本方案得到的单个核细胞中几乎4 0 % 为单核细胞和巨噬细胞。

附 加 材 料（其他材料见基本方案，带V 项 目 见 附 录 1)

单 个 核 细 胞 悬 液（见基本方案）

R P M I -20，完全培养基

150c m 2斜颈组织培养瓶

1.18〜20°C ， 300 g 离心单个核细胞lOmin，弃上清，室温下用RPMI- 2 0完全培养基重悬沉淀，调整细胞浓度至2 X 10⁶个细胞/ml。将 50m l 细胞悬液移入150 cm2组织培养瓶 ，水平放置于37°C ， 5 % C0 2培养箱中孵育lh。

2.将非贴壁的淋巴细胞缓缓倒入离心管，用 37°C的 RPMI-IO完全培养基轻轻冲洗组织培养瓶，洗液也加入离心管中。

3.重复步 骤 1 和 2 。再次离心细胞，弃上清，重悬沉淀于5〜IOml RPMI-IO完全培养基中。计 数 单 个 核 细 胞（附 录 3A ) ， 并 用 台 盼 蓝 排 除 法 检 测 细 胞 活 力（通常活细胞> 9 0 % ，附 录 3 0 。如果需要，可以 从 组 织 培 养 瓶 中 回 收 贴 壁 细 胞（单核细胞和巨噬细胞），见 单 元 8. 5 。

4.如果需要，可用流式细胞仪检测PBM C 纯 度（单 元 4. 2 ) 。