外源DNA片段在质粒载体中的克隆实验

限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

DNA片段 PUC18

R.E buffer 水 凝胶 氯仿 异戊醇 乙醇

离心机

1.  载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
   50 μl反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）
   DNA           30 ul
   R.E           1 ul
   10xbuffer        5 ul
   

   ddH2O           14 ul
   

   
   外源片段酶切产物和5 ul 37 ℃反应1hr，分别取8 ul PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA
   
   2.  加入ddH2O 150  （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 g离心10 min；
   
   3.  吸取上清，加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20 ℃放置15分钟以上；
   
   4.  12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟；
   
   5.  ddH2O（1.5 ml ddH2O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 ul 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10  tube中）；
   
   6.  按以下反应去除载体PUC18的5'磷酸基团，50 ℃反应30 min 以上
   DNA                   20 ul
   

   CIAP（TaKaRa）        0.5 ul
   

   buffer              4.0 ´10 μl

   ddH2O               15.5 ul
   

   
   7.  70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；
   
   8.  按2－5步纯化载体，溶于10 ul ddH2O；
   
   9.  连接反应
   DNA                10 ul
   pUC18            2.5 ul
   buffer           1.5 ´ 5 ul
   mT4 ligase   3 U/ul
   
   16 ℃水浴过夜
   
   10.  转化大肠杆菌感受态细胞
   
   11.  转化子的鉴定

   
   

1. DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。

2. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。

1. 克隆中所用到的几种酶：（1）限制性内切酶（2）碱性磷酸酶（3）连接酶（体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶），但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。

2. 载体的负载能力：即能克隆多大的DNA片段，是否有合适的限制性内切酶位点，酶切位点的性质，粘性或平末端，是否有选择重组克隆的其它标记，如蓝白斑筛选等。