多光子激光扫描显微镜是在激光共聚焦扫描显微镜基础上发展起来的。继 1997年伯乐公司推出了第一台双光子激光扫描显微镜后，1998年 5月德国莱卡公司也加入竞争。 多光子扫描显微镜具有成像穿透深度深、光学三维分辨率高等特点，为实时、原位观察生物活体提供了最佳方法。
1、钙生物学研究
与荧光探针技术相结合 ,多光子显微镜可以对细胞内的钙离子动态过程进行实时监测、对钙离子浓度进行准确测量。 多光子可以实现钙离子探针与其他荧光染料的复合测量 ,研究钙波、钙振荡现象同其他信号转导过程的联系 ,使对钙信号的研究从亚细胞层次深入到分子水平。
2、神经学研究
在神经学研究中，Rose等首次用双光子激发对海马趾神经刺和锥状神经树中钠离子进行了瞬时动态测量. Cox用双光子显微镜证明了动作电位能够影响神经轴,导致能够引起神经递质释放和目标神经突触激活的钙离子内流。
3、胚胎学与组织学研究
胚胎发育本身包含复杂的生命信息，对外界条件十分敏感。共聚焦显微成像往往妨碍胚胎发育，不能得到胚胎正常发育的信息。 多光子成像非常适合胚胎发育的长期动态跟踪。
4、分子生物学研究
利用某些报告基因，多光子成像可以在不破碎细胞前提下显示基因在生物体内的表达，已广泛应用于基因转染和表达研究。
5、代谢过程研究
多光子技术可以用来对标记物质的代谢过程进行监测，记录代谢物的分布、代谢速度，从而突破传统的生物化学分析方法，从单个细胞层次实时研究代谢过程，已应用于药物、糖类等物质的代谢研究。
6、笼锁化合物的定点释放
许多重要的生物物质都有其笼锁化合物。 处于笼锁化合物状态的生物物质功能被封闭；特定波长的光可以使其光解笼锁，恢复活性和功能；人为的控制笼锁化合物的定点、定时释放 ，便于研究生物物质的代谢过程 ，并根据治疗、发育的要求进行人工操控。
7、对生物体内某些物质的定点操控
除了对笼锁化合物释放的控制，多光子技术可以方便地用于对细胞或者组织 [5]内某些物质的定点操控。