多巴胺ELISA试剂盒使用说明（二）

发布时间：2020-07-06 12:20 原文链接：多巴胺ELISA试剂盒使用说明（二）

7、实验所需器材（但试剂盒不提供）

1）移液器（10；10-100；100-1000μL）

2）轨道摇床（200-900rpm）

3）旋涡混合器

4）带储器的8通道移液器

5）洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统

6）酶标仪

7）双蒸水或去离子水

8）吸水纸，取样吸头，计时器

9）样品稀释用试管。

8、手动操作

8.1实验前说明

注意	用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。
注意	试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1：5的比例进行稀释（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）。标准品无需稀释。

8.2样品的稀释

如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：

样品	待稀释	稀释液	备注
血浆	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	双蒸水	提取步骤前
尿液	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	0.1N的HCl	提取步骤前

8.3样品、标准品和质控品的提取（提取板）

1）	将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各20μL和500μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入500μL双蒸水以消除体积差别。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液
3）	盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。
4）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
5）	每孔加入2ml双蒸水
6）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
7）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
8）	每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。
9）	在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板）
10）	快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
11）	每孔加入2ml双蒸水。
12）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
13）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
14）	每孔加入300μL Release缓冲液。
15）	在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板）

已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。

8.4冻干粉或浓缩成分的准备

稀释	成分		稀释液	比例	备注	贮存	稳定性
25ml	洗涤液	225ml	双蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
60μL	酶联物	6ml	洗涤缓冲液（已稀释好）	1:101	临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		临时配置，仅能使用一次	18-25℃	5h

9、实验步骤（手动操作）

9.1 COMT酶溶液的准备

注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置

在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶联溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*，COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。

*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。

9.2样品、标准品和质控品的酶化

注意	如果使用自动置换型移液器，请将取样吸头内的残余液体加回到提取板相应的微孔内。将提取板置于一斜坡位置比较适当。

科研用组织匀浆和细胞培养上清可按如下建议处理：细胞培养上清必须根据其培养基及其相应浓度进行处理：根据尿液样品的操作说明（至少提取20ul上清液），未稀释样品的灵敏度大概为1.0ng/ml。如果基质内添加了血清（FCS），血浆（至少提取500ul上清）操作的灵敏度可以是5pg/ml。无高氯酸的组织匀浆可用做匀浆样品，具体信息请咨询IBL汉堡公司。

9.3检测尿液和血浆中的多巴氨

1	在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液，轻轻振荡。
2	在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液（血浆样品孔除外）。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。将100ul提取好的血浆样品加入到相应的微孔中。在此加样步骤中，可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色，轻轻振荡。
3	在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。
4	盖板，在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育120min
5	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。
6	在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶联物。
7	盖板，在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育60min
8	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。
9	如果可以的话，使用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用自动置换型移液器并避免气泡产生。
10	在每一微孔中加入200ul底物液。
11	在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育40min
12	在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，轻轻振板以使溶液混合均匀。
13	加终止液后60min内405nm处读取OD值。（参考波长：620-650nm）

10、自动操作步骤

10.1实验前说明

注意	用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。
注意	试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1：5的比例进行稀释（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）。标准品无需稀释。

10.2样品的稀释

如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：

样品	待稀释	稀释液	备注
血浆	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	双蒸水	提取步骤前
尿液	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	0.1N的HCl	提取步骤前

10.3样品、标准品和质控品的提取（提取板）

1）	将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各30μL和750μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入750μL双蒸水以消除体积差别。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液
3）	盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。
4）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
5）	每孔加入2ml双蒸水
6）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
7）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
8）	每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。
9）	在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板）
10）	快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
11）	每孔加入2ml双蒸水。
12）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
13）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
14）	每孔加入450μL Release缓冲液。
15）	在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板）

已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。

10.4冻干粉或浓缩成分的准备

稀释	成分		稀释液	比例	备注	贮存	稳定性
25ml	洗涤液	450ml	双蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
150μL	酶联物	15ml	洗涤缓冲液（已稀释好）	1:101	临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		临时配置，仅能使用一次	18-25℃	5h

11、实验步骤（自动操作）

11.1 COMT酶溶液的准备

注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置

*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。

11.2实验步骤

在使用自动方法做实验时，我们建议按1：10的比例预先稀释提取好的标准品、质控品和尿液样品（如果是手动操作则用Release缓冲液进行稀释）。如果稀释了，第二个步骤可简化为：将已提取好的血浆样品、已提取好的标准品（按1：10的比例预先稀释）、质控品和尿液样品各100μL加入到微孔中。在进行预稀释时，应当考虑到自动操作的死容积。

1）在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液，轻轻振荡。

2）在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液（血浆样品孔除外）。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。在此加样步骤中，可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色，轻轻振荡。

3）每孔中加入50μL多巴胺抗血清。

4）盖板。在振荡器（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育120min

5）弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。

6）每孔加入100μL酶联物

7）盖板。在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育60min

8）弃取孔内反应液，用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。

9）加底物液和终止液时，其时间间隔应相同

10）每孔加入200μL底物液

11）在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育40min。如果自动操作时的温度超过25℃时，则应相应的将温育时间缩短至30min。

12）每孔加入50μL PNPP终止液以终止底物反应，轻轻振荡包被板以充分混合试剂成分。

13）加终止液后60min之内405nm处读取OD值。（参考波长：620-650nm）

12、期望值

实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%），建议每个实验室读确定自己的正常值范围：

	尿液	血浆
μg/d	nmol/d	pg/mL	nmol/L
多巴胺	＜600	＜3917	＜100	＜0.65

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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