多羟基反应单克隆抗体的鉴定、生产和使用——用于免疫亲和层析
我们最先使用了一类特殊的单克隆抗体, 并将其用于免疫亲和层析。这些抗体可以用于温和的免疫亲和层析, 因为洗脱条件只需要联合使用无离液盐和低分子质量的多羟基化合物 (多元醇），此条件下蛋白质呈非变性状态。我们把这种抗体归类为多羟基反应单克隆抗体 (PR-mAb)。
我们的实验室研究蛋白质转录。因此，我们分离出的大部分
PRmAb，是原核或真核系统中与转录相关的 mAb。对于主攻分离的科学家，真核生物转录系统具有重大的挑战性,
因为实际上许多因子都是多亚基蛋白质。例如，真核生物的 RNA 聚合酶 n(RNAPn) 含 12 个亚基 (12
个不同基因产物）。然而，从启动子起始转录，rnapn 还需要转录因子 TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF 和
TFIIH[综述见 Woychik 和 Hampsey(2002)]。除 TFIffi 外,
所有这些转录因子均是由两个或两个以上的亚基组成。大蛋白质复合物是使用 PR-mAb 免疫亲和层析的理想对象。我们已经研发用于大肠杆菌
RNAPCThompsonetal.,1992) 和真核生物 RNAPII(Thompsonetal.，1990) 的
PR-mAb，以及针对一些真核生物转移因子 (表 28.1) 的 PR-mAb。
PR-mAb 技术应用中最值得注意的是，采用我们的 PR-mAb8WG16 纯化的酵母 RNAPIKEdwardsetal.,1990) 已用于蛋白质复合物结晶（Crameretal.，2000)。其他实验室已成功分离出多种 PR-mAb, 并应用于纯化目标蛋白质 (Jiangetal.，1995;Lynchetal.，1996;Nagyetal.,2002)。也可以对已经确定的 mAb 进行筛选，将其用于多羟基反应。
目前已经发表了一些关于 PR-mAb 的综述（BurgessandThompson,2002;Thomp-sonandBurgess，1996,2 0 01;Thompsonetal.，2 00 6)。本章中，我们将对其中一些方法进行更新。我们还将介绍采用非常便宜的细胞培养系统制备大量 RP-mAb 的方法，以及以同样的方式用小鼠腹水制备极少量的 mAb。最后，根据抗体的多羟基反应特点，以重组 DNA 的方法, 用 RP-mAb 的表位标记无关目标蛋白质，可进而通过温和的多羟基-洗脱法纯化该蛋白质。
(1) 通过筛选大量单抗（218 个抗原特异孔），我们预计 PR-mAb 占单克隆抗体的 5%~10%(Thompsonetal.，1992)。
⑵在主孔 (master-well) 阶段进行筛选可以立即鉴定 PR-mAb。
(3)PR-mAb 不受小鼠 IgG 亚型的限制。也已在大鼠的 mAb 中鉴别筛选了 PR-mAb(R.R.Burgess, 数据未公开发表）。
(4) 多数 PR-mAb 受不同种盐和多羟基化合物组合的影响。最常见的是 0.75mol/L 硫酸铵或 0.75mol/L 氯化钠与 30%~40% 丙二醇联合使用。
(5)PR-mAb 可以是高亲和力抗体。事实上, 在稀释溶液中，高亲和力是保证 mAb 与抗原有效结合的首要条件。洗脱时成为低亲和力抗体。
(6) 多数 (不是全部)PR-mAb 受不同种盐和多羟基化合物组合的影响。经验证，盐包括硫酸铵、氯化钠、乙酸钠和谷氨酸钾! 多元醇包括丙二醇、乙二醇、2，3-丁二醇，有时甘油也可。
(7) 盐和多经基化合物通常用来作为蛋白质稳定剂, 其温和洗脱作用可以保留抗原的生物学特性及结构的完整性，甚至可用于多亚基复合物（CrameretaL，2000;Thomp.sonetal.，1990)。
我们采用杂交瘤技术制备 mAb(Harl o wandLane,1988)，即将抗原刺激的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞株融合。实验证明应首选高免小鼠; 仅 5%~10% 的单抗是 PR-mAb，因此需要大量的原始杂交瘤细胞才可能分离出 PR-mAb。但可以使用其他方法制备 mAb, 如反转录病毒感染浆细胞 (Largaespadaetal.，1”6)，或通过重组技术构建抗体库。
无论何种来源的抗体，必须具备抗原特异性。我们发现，标准 (ELISA) 是行之有效的方法。接着我们通过改良的 ELISA 法筛选抗体，即 ELISA-elution 检测法。该方法是在标准 ELISA 的基础上，在加入酶联二抗前，增加了用盐和多羟基化合物联合处理特异性的抗原抗体复合物的步骤。接着，用盐/多羟基化合物解离抗原抗体复合物后, 通过底物反应进行定量。ELISA-elution 检测法的一般程序如下所述。