多肽的合成与应用进展（一）

  多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。随着美国FDA1999年开始允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能和人们对多肽中各氨基酸系列的功效的不断了解,作为药物和营养品的多肽产品不断被开发出来,多肽的研发已成为近年生命科学研究的一大热点[1~7]。

　　1 多肽的合成

　　1.1 多肽合成的分类

　　多肽合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。为得到具有特定顺序的合成多肽,当合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体时,应将不需要反应的基团暂时保护起来,然后再进行连接反应,以保证合成的定向进行。

　　多肽的化学合成有固相合成和液相合成之分,其主要的区别在于是否使用固相载体。多肽液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略,逐步合成简洁迅速,被用于各种生物活性多肽片段的合成;片段组合法为合成含100个以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路线,并已成功地合成了多种有生物活性的多肽,其最大的特点是易于纯制。1963年,Merrifield创立了固相合成法,将氨基酸的C末端固定在不溶树脂上,然后在此树脂上依次缩合氨基酸、延长肽链。固相合成法又可分为Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9-芴甲基氧羰基)法。在传统液相和固相合成多肽方法的基础上,人们又发展了氨基酸的羧内酸酐(NCA)法、液相分段合成法、组合化学法等。

　　在生物合成多肽方面,除了常用的发酵法、酶解法外,随着生物工程技术的发展,DNA重组技术也被应用于多肽合成。

　　1.2 氨基酸的羧内酸酐法[8,9]

　　氨基酸的羧内酸酐是氨基酸的一种衍生物,它的氨基保护基也活化羧基。NCA法属于阴离子开环聚合机理,其引发剂可选用多种亲核试剂或碱类。采用NCA法合成多肽的基本反应包括:在碱性条件下,氨基酸阴离子进攻NCA形成较为稳定的氨基甲酸根离子,在酸化时该离子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又进攻其它的NCA,如此反复进行下去(图1)。

　　NCA法具有合成周期短、操作简单、成本较低、产物分子量高等优点,在目前多肽合成中所占比例较大,技术也较为通用。但是,采用NCA逐步法只能合成短链多肽片段[9]。

　　1.3 液相分段合成法[10~19]

　　液相分段合成法是多肽片段在溶液中依据其化学专一性或化学选择性,自发连接成长肽的合成方法,其优点是能得到长肽,但技术还不完善。常用的连接技术主要有:天然化学连接[11]、化学区域选择连接[12,13]、可去除辅助基连接[14]、光敏感辅助基连接[15]、施陶丁格连接[16,17]和正交化学连接[18,19]。

　　天然化学连接方法(图2)是以C端为硫酯的多肽与N端为半胱氨酸(Cys)残基的多肽反应得到以Cys为连接位点的多肽。由于连接所合成的多肽必须含Cys残基,限制了该方法的应用。

　　化学区域选择连接方法(图3)是以2-巯苄基作为辅助基与硫酯反应。加快了缩合速度,辅助基易脱除,且去除辅助基连接是以苯胺的衍生物NA-(1-苯基-2-巯乙基)为辅助基团,对强酸保持稳定,使得N端多肽片段较易合成。

　　光敏感辅助基连接方法(图4)是以NA-2-巯基-1-(2-硝基苯)乙基为辅助基(见光分解易脱除)多肽合成的。